Cromatografie lichidă de înaltă performanță

De la Wikipedia, enciclopedia liberă.
Salt la navigare Salt la căutare
Un HPLC
Model HPLC compact

Cromatografia lichidă de înaltă performanță (în engleză High Performance Liquid Chromatography, cunoscută anterior sub numele de cromatografie lichidă de înaltă presiune sau cromatografie lichidă de înaltă presiune), mai simplu cunoscută prin acronimul englezesc HPLC este un tip de cromatografie lichidă care reprezintă evoluția instrumentală a lichidului cromatografie pe o coloană clasică.

Este o tehnică cromatografică care permite separarea a doi sau mai mulți compuși prezenți într-un solvent prin exploatarea echilibrului de afinitate dintre o „fază staționară” plasată în interiorul coloanei cromatografice și o „fază mobilă” care curge prin ea. O substanță mai asemănătoare cu faza staționară decât faza mobilă durează mai mult timp pentru a călători prin coloana cromatografică (timp de retenție), comparativ cu o substanță cu afinitate scăzută pentru faza staționară și mare pentru faza mobilă.

Eșantionul de analizat este injectat la începutul coloanei cromatografice unde este „împins” prin faza staționară de faza mobilă prin aplicarea presiunilor de ordinul sutelor de atmosfere. Pentru a obține o eficiență ridicată în separare este necesar ca dimensiunea particulelor de umplere să fie foarte mică (de obicei, acestea au diametre cuprinse între 3 și 10 µm), din acest motiv este esențial să aplicați o presiune ridicată dacă doriți să mențineți o viteză rezonabilă, debitul eluantului și deci un timp de analiză adecvat.

La sfârșitul coloanei se aplică un detector ( IR , UV-VIS, spectrofluorimetric, spectrometru de masă ) și un calculator care permit o analiză continuă a ieșirii coloanei și, prin urmare, să poată cuantifica și / sau identifica substanțele injectate printr-un cromatogramă specifică.

Principalele avantaje ale acestei tehnici sunt: ​​dimensiunea redusă a coloanei care evită problemele abaterilor longitudinale (mișcări ale fazei mobile longitudinale) și ale căilor alternative; rata de eluție constantă și reglabilă (trecerea fazei mobile prin coloană); viteză redusă de execuție; cantități mici de compus necesare analizei (în ordinea a 5-10 micrograme de probă solubilizată într-un solvent specific) toate în favoarea unei precizii și precizii mai mari.

Principalul dezavantaj al dispozitivelor HPLC este costul mult mai mare în comparație cu cromatografia pe coloană tradițională, chiar dacă nu este posibil să se compare cele două metode, deoarece acestea au domenii de aplicare diferite.

Tipuri de HPLC

Cele mai importante tehnici de cromatografie lichidă sunt:

Deseori, diferitele proceduri sunt complementare unele cu altele.

Instrumentaţie

Datorită presiunilor mari de funcționare, instrumentarea pentru HPLC este de obicei mai complexă decât cea pentru alte tehnici cromatografice. Principalele componente ale echipamentului HPLC sunt:

  • Containere pentru faza mobilă
  • Pompe
  • Sisteme de introducere a probelor
  • Coloană
  • Umplerea coloanei
  • Detectoare

Containere pentru faza mobilă

Instrumentele moderne HPLC sunt echipate cu diferite recipiente pentru solvenții care vor fi folosiți ca fază mobilă. Solvenții trebuie să fie în mod necesar lipsiți de impurități, inclusiv gaze dizolvate și particule, pentru a nu afecta bunătatea analizei; din acest motiv containerele integrează adesea sisteme de degazare, alambicuri și filtrare. În majoritatea cazurilor, solvenții sunt lăsați în recipientele originale, realizate din material inert (sticlă sau oțel inoxidabil).

Separările cu HPLC pot fi realizate cu eluție izocratică , adică folosind un eluent a cărui compoziție nu variază în timpul analizei sau cu eluție în gradient , în care natura eluantului variază în timpul analizei în mod continuu sau pas cu pas. A doua metodă are efecte similare cu programele de temperatură adoptate în cromatografia de gaze , ajută în multe cazuri la îmbunătățirea rezoluției analizei sau la scăderea timpului acesteia. Pentru a funcționa cu eluare în gradient, este necesar ca instrumentul să fie echipat cu o cameră de amestecare în care solvenții luați din containere să fie amestecați și apoi trimiși la coloană.

Pompe

Pompa HPLC

Pompele HPLC trebuie să îndeplinească cerințe foarte stricte, printre care cele mai importante sunt:

  • capacitatea de a rezista la presiuni de până la sute de atmosfere
  • stabilitatea presiunii generate (importantă pentru a nu crea zgomot în cromatogramă)
  • livrează fluxuri de fază mobilă în domeniul obișnuit de la 0,1 la 10 ml / min
  • asigura reproductibilitatea debitului relativ mai bun de 0,5%
  • rezistență la coroziune

Principalele tipuri de pompe utilizate în instrumente sunt: ​​pompele cu piston alternativ, pompele cu seringă și pompele pneumatice.

Pompe alternative cu piston

Pompele cu piston alternativ sunt împărțite în două tipuri: piston unic și pereche de pistoane (numite și pompe cu piston alternativ), acestea sunt cele mai frecvente în instrumentele comerciale. Presiunea este transmisă de piston, acționată de un motor, către o cameră mică în care solventul este făcut să curgă grație deschiderii și închiderii a două supape sincronizate cu pulsația pistonului. Cursa de aspirație a solventului se efectuează la viteza maximă posibilă a motorului, în timp ce cursa de distribuție este în raport cu debitul dorit. Sistemul are dezavantajul de a genera o presiune pulsată și, prin urmare, necesită un amortizor de presiune. Pompele cu mișcare alternativă deplasează perechea de pistoane la o viteză constantă legată de debitul dorit și într-o direcție alternativă, în timp ce un piston este în faza de aspirație, al doilea se află în faza de distribuție și invers. Pompele cu piston alternativ sunt capabile să susțină în mod stabil presiuni de peste 600 atm, asigurând astfel debituri bune și într-o gamă largă, sunt, de asemenea, ușor de adaptat la eluții de gradient.

Pompe cu seringă

Pompele cu seringă, numite și pompe cu deplasare, constau dintr-un cilindru care conține solventul și un piston intern. Pistonul este împins de un motor aplicat pe un șurub, generând o presiune neimpulsată. Astfel de pompe garantează un debit stabil și suficient de puternic, totuși au de obicei o capacitate mică a rezervorului și prezintă dezavantaje la schimbarea solventului.

Pompele pneumatice

În pompele pneumatice solventul este conținut într-un recipient flexibil, comprimat din exterior cu gaz sub presiune. Debitul rezultat nu este pulsat, dar de obicei nu este foarte puternic în comparație cu cel generat de alte tipuri de pompe. Alte dezavantaje sunt date de capacitatea redusă a rezervorului și de faptul că entitatea fluxului depinde semnificativ de vâscozitatea solventului, făcând astfel aceste pompe nepotrivite pentru eluții în gradient.

Sisteme de introducere a probelor

Supapă de injecție

Reproductibilitatea cantității de probă introdusă în coloană reprezintă punctul critic pentru precizia unei analize cu HPLC. Sistemele utilizate în prezent sunt capabile să atingă precizii relative de 0,1% și să varieze cantitatea de probă introdusă într-un interval cuprins între 5 și 500 μL, există și supape de injecție pentru micro probe cu volume cuprinse între 0,5 și 5 μL. Sunt supape capabile să adăpostească și să transfere proba, fără a întrerupe fluxul din faza mobilă prin coloană. Sunt construite din oțel.

Coloane

Coloană pentru HPLC

Este mediul în care materialul este separat și, în funcție de solvenți, analiții pot atinge rate de eluție diferite, pe baza compoziției lor. Cel mai utilizat material pentru construcția coloanelor HPLC este oțelul inoxidabil lustruit, dacă operați la presiuni sub 10 atm folosiți și coloane de sticlă groase. Lungimea coloanelor este de obicei între 10 și 30 cm, dar este posibil să aveți coloane mai lungi pentru nevoi speciale. Diametrul intern este între 2 și 4,6 mm și diametrul particulelor de umplere între 3,5 și 10 µm. Există, de asemenea, modele de coloane proiectate recent, care sunt mai scurte și mai subțiri, care permit timpi de analiză mai scurți și un consum mai mic de solvent.

Coloanele comerciale sunt adesea echipate cu cuptoare termostatice pentru a menține temperatura coloanei sub control până la zecimea de grade Celsius. Menținerea unei temperaturi constante duce, de obicei, la cromatograme mai bune.

Deși solvenții utilizați în HPLC sunt purificați intenționat, este întotdeauna posibil să conțină contaminanți care ar putea afecta buna funcționalitate a coloanei. Pentru a depăși această problemă și, prin urmare, a crește durata medie de viață a coloanelor analitice, se aplică coloane de protecție, care sunt mai scurte decât coloanele analitice, în care se trece faza mobilă înainte de a accesa coloana analitică. Practic coloana de protecție acționează ca un filtru. De asemenea, servește la saturarea fazei mobile cu faza staționară, reducând astfel pierderile de fază staționară din coloana analitică.

Umpluturi de coloane

Umpluturile utilizate în HPLC sunt în esență de trei tipuri, cu particule de film , cu particule poroase și cu tehnologie cu miez topit .

Particulele de film sunt utilizate aproape exclusiv pentru coloanele de protecție. Sunt granule sferice și ne poroase din sticlă sau material polimeric, cu o dimensiune cuprinsă între 30 și 40 µm. Un strat poros de silice , alumină sau rășină schimbătoare de ioni este depus pe suprafața granulelor. Dacă este necesară o fază staționară lichidă, aceasta poate fi aplicată prin adsorbție.

Particulele poroase au diametre cuprinse între 3 și 10 µm, cel mai utilizat material este silice microporoasă, dar pot fi realizate și din alumină sau rășină schimbătoare de ioni. De asemenea, în acest caz se aplică acoperiri specifice, legate fie prin adsorbție, fie prin legături chimice la suprafața particulelor.

Particulele cu miez condensat au o dimensiune mai mică de 2 µm, de obicei este obișnuit să se atribuie numele UHPLC (Ultra HPLC) instrumentației care utilizează aceste coloane [1]

Detectoare

Pentru ca un detector să fie potrivit pentru utilizarea în HPLC, acesta ar trebui să îndeplinească următoarele caracteristici:

  • Sensibilitate adecvată, care depinde în mod evident atât de nevoile particulare ale operatorului, cât și de tipul de eșantion de analizat
  • bună stabilitate și reproductibilitate
  • răspuns liniar pentru mai multe ordine de mărime
  • timp scurt de răspuns
  • ușurință mare de utilizare și fiabilitate
  • uniformitatea răspunsului față de toți analiții sau, dimpotrivă, specificitate ridicată pentru compuși anumiți
  • revelație nedistructivă
  • volum intern mic pentru a evita lărgirea benzilor

Detectoarele cele mai utilizate sunt absorbția UV, apoi există metodele de fluorescență (pentru proteine), pe indicele de refracție, constanta dielectrică, detectoarele electrochimice, spectrometrul de masă și altele.

Detectoare de absorbție

Absorbanța celulelor pentru HPLC este de obicei în formă de Z, are o cale optică de la 2 la 10 mm și volume între 1 și 10 μL. Aceste celule mici rezistă în mod normal la presiunea câtorva zeci de bare. Se folosesc ambii detectoare cu fascicul dublu, în care un fascicul este trecut prin celulă și detectat cu compensarea celuilalt fascicul, atenuat de un filtru, și detectoare cu fascicul unic.

Cea mai exploatată regiune a spectrului în detectoarele de absorbanță pentru HPLC este UV , în al doilea rând există regiunea vizibilă și, într-o măsură mai mică, infraroșu . Se utilizează atât detectoare de filtru ( fotometre ), cât și detectoare monocromatoare ( spectrofotometre ).

Cele mai simple fotometre HPLC folosesc o lampă cu mercur , din care este selectată de obicei banda centrată la 254 nm, dar sunt utilizate și benzile la 250, 313, 334 și 365 nm. Diferite grupe funcționale absorb atât organice cât și anorganice la aceste lungimi de undă. De asemenea, se utilizează surse de deuteriu sau tungsten, echipate cu o serie întreagă de filtre. De obicei, gestionarea filtrelor este încredințată unui procesor electronic care optimizează alegerea.

Pentru detectoarele cu spectrofotometru cu rețea de difracție puteți alege diferite moduri de utilizare. Întreaga cromatogramă poate fi scanată cu o singură lungime de undă; sau dacă vârfurile eluatului sunt destul de separate, se pot alege lungimi de undă specifice pentru fiecare vârf, dacă este urmată a doua metodă, este esențial să folosiți un procesor pentru a selecta lungimea de undă optimă pentru fiecare vârf. De asemenea, puteți opri fluxul fazei mobile dacă doriți să obțineți un spectru pe o regiune de lungime de undă largă.

Câmpul de aplicabilitate al detectoarelor cu infraroșu în HPLC este destul de slab datorită solvenților utilizați ca fază mobilă, de obicei apă sau alcooli, care au benzi de absorbție diferite în IR și riscă să acopere semnalele analiților.

Detectoare de fluorescență

Detectoarele de fluorescență au avantajul unei sensibilități mai mari față de metodele de absorbție, de obicei mai mari decât un ordin de mărime. Cu toate acestea, acestea au dezavantajul unui câmp de aplicabilitate mai mic, deoarece numărul speciilor absorbante este considerabil mai mare decât cele fluorescente. Cu toate acestea, detectoarele de fluorescență pot fi utilizate și pentru analiții non-fluorescenți dacă pot fi tratați cu reactivi care dau produse fluorescente prin derivatizarea analitului.

Fluorescența este observată printr-un detector fotoelectric plasat la 90 ° față de sursa de excitație, care este de obicei o lampă cu mercur. Radiația fluorescentă este izolată prin filtre. În cele mai sofisticate instrumente, se folosesc lămpile cu xenon și grătarele de difracție.

Detectoare de indice de refracție

Detectoarele bazate pe variația indicelui de refracție datorită prezenței substanțelor dizolvate în faza mobilă au marele avantaj de a avea un câmp de aplicabilitate extrem de larg; sunt, de asemenea, foarte fiabile și nu sunt afectate de variațiile fluxului. Cu toate acestea, au o sensibilitate și o selectivitate slabe, nu sunt aplicabile eluțiilor cu gradient de solvent (ar exista o derivație a liniei de bază) și trebuie să fie termostatate la miimi de grade centigradi, deoarece performanțele lor depind puternic de temperatură și de schimbarea vitezei de fază. mobil.

Detectoare electrochimice

Există detectoare electrochimice bazate pe conductivitate , voltametrie , amperometrie și coulometrie . Au un domeniu larg de aplicabilitate.

Detectoare de matrice de diode

Acestea sunt detectoare ultraviolete care, spre deosebire de detectoarele obișnuite, permit înregistrarea simultană a spectrului în funcție de lungimea de undă , mai degrabă decât efectuarea scanărilor, utilizând o serie de diode . În acest fel, este posibil să se obțină grafice tridimensionale în funcție de absorbanță, lungime de undă și timp sau hărți de absorbanță (timp versus lungime de undă), pe lângă spectrele și cromatogramele UV clasice.

Detectoare de spectrometru de masă

HPLC interfațată cu un ICP-MS

Aplicabilitatea spectrometrului de masă ca detector pentru HPLC este complicată de cantitatea mare de eluat provenit din coloană, care nu se conciliază cu necesitatea unui vid ridicat în analizele spectrometrului de masă. Prin urmare, a trebuit să se lucreze mult pentru a dezvolta interfețe adecvate care să elimine sau să reducă solventul utilizat ca eluant.

În ionizarea prin electrospray, faza mobilă provenită din coloană este introdusă într-un capilar de electrospray cu un debit de ordinul 1 µl / min (este posibil să se mărească debitul până la 1 ml / min, totuși agravarea semnalului / raportul de zgomot). Capilarul este menținut la un potențial între 2,5 și 4kV în raport cu un contra-electrod. La capătul acului, eluatul este nebulizat, diferența de potențial forțează picăturile să-și asume o sarcină de suprafață de aceeași polaritate cu sarcina acului. Picăturile sunt respinse de ac și se îndreaptă spre contraelectrod. Pe măsură ce picăturile traversează spațiul dintre ac și contraelectrod, există evaporarea solventului și o consecință a creșterii densității de încărcare a suprafeței, care favorizează dezintegrarea picăturilor în picături din ce în ce mai mici. Procesul are loc în cascadă până când tot solventul se evaporă și rămâne doar analitul ionizat, care traversează contraelectrodul și trece la spectrometrul de masă. În acest proces există o fragmentare redusă a moleculelor de analit , astfel încât spectrele sunt simplificate, dar sărace în informații.

În interfața termospray, eluatul este introdus într-un capilar din oțel încălzit, în care analitul este vaporizat și ionizat. Ionizarea se datorează mecanismelor de transfer de sarcină induse de compuși, cum ar fi acetat de amoniu sau trietilamină , adăugați la eluant. O diferență de potențial se aplică capilarului care conduce analitul ionizat spre spectrometrul de masă. Debitele adoptate sunt de ordinul a 2 ml / min. În ceea ce privește ionizarea prin electrospray, există puțină fragmentare și, prin urmare, spectre sărace în informații, în plus, poate fi utilizat numai cu eluenți polari, singurii capabili să solubilizeze agenții ionizanti tipici prin transfer de sarcină.

Au fost dezvoltate numeroase alte interfețe, inclusiv ionizarea chimică la presiune atmosferică (APCI) și fotoionizarea la presiunea atmosferică.

Notă

  1. ^ UHPLC cromatografie lichidă, într-adevăr „Ultra”? , pe lab-italia.it . Adus pe 2 iulie 2013 (arhivat din original la 14 septembrie 2015) .

Bibliografie

  • DE Skoog, JJ Leary. Chimie analitică instrumentală . Edises, 1995

Elemente conexe

Alte proiecte

linkuri externe

Chimie Portalul chimiei : portalul științei compoziției, proprietăților și transformărilor materiei
Adus de la „ https://it.wikipedia.org/w/index.php?title=Liquid_chromatography_ad_high_performance&oldid=116997059 ”