Microarrays de ADN

Microarrays

Un microarray de ADN (cunoscut în mod obișnuit ca cip genetic , cip ADN , biocip sau matrice de densitate mare ) este o colecție de sonde microscopice de ADN atașate la o suprafață solidă precum sticlă, plastic sau cip de siliciu care formează o matrice (matrice). Aceste matrici permit examinarea simultană a prezenței multor gene într-o probă de ADN (care adesea poate reprezenta și întregul genom sau transcriptomul unui organism). O utilizare tipică este de a compara profilul de expresie genică al unui individ bolnav cu cel al unui sănătos pentru a identifica ce gene sunt implicate în boală.

Microarrays exploatează o tehnică de hibridizare inversă, care constă în fixarea tuturor segmentelor de ADN (numite sonde ) pe un suport și în schimb marcarea acidului nucleic pe care dorim să îl identificăm (numit țintă ). Este o tehnică care a fost dezvoltată în anii 1990 și astăzi permite analiza expresiei genelor prin monitorizarea ARN-urilor produse de mii de gene simultan.

Pentru a studia ARNm, acestea sunt mai întâi extrase din celule, transformate în ADNc , cu utilizarea unei enzime numite transcriptază inversă și , în același timp, etichetate cu o sondă fluorescentă. Când apare hibridizarea între sonda de pe matrice și cADN țintă , cADN țintă va rămâne legat de sondă și poate fi identificat pur și simplu prin detectarea locației în care a rămas legată. Principalele aplicații ale microarrays-urilor sunt analiza polimorfismelor SNP, compararea populațiilor de ARN ale diferitelor celule și utilizarea pentru noi metodologii de secvențiere a ADN-ului, precum și pentru screeningul secvențelor de sens și antisens în căutarea oligonucleotidelor utilizate în domeniu. farmaceutic.

Segmentul de ADN legat de suportul solid este cunoscut sub numele de sondă. Mii de sonde sunt utilizate simultan într-o matrice. Această tehnologie a provenit dintr-o tehnică mai simplă cunoscută sub numele de Southern blot , în care fragmentele de ADN atașate la un substrat sunt testate de sonde genetice care au secvențe cunoscute. Măsurarea expresiei genelor prin microarray prezintă un interes considerabil atât în domeniul cercetării de bază, cât și în diagnosticul medical, în special al bolilor bazate pe genetică, unde expresia genetică a celulelor sănătoase este comparată cu cea a celulelor afectate de boală la examinare. .

Producție

Microarrays-urile pot fi fabricate folosind diferite tehnologii, cum ar fi tipărirea micro-canelurilor, cu un anumit micro-pin ascuțit pe o placă de sticlă unde sonda materialului genetic obținut prin clonare utilizând tehnica PCR ( fotolitografie ) va fi atașată covalent.

Fiecare clonă unică este plasată în poziția exactă de pe lamă de către un robot. Este evident că această tehnică necesită echipamente robotice foarte sofisticate. Nucleul echipamentului constă dintr-un „grup de scriere” care preia una sau mai multe probe de ADNc folosind plute și le transferă pe lamele de microscop, mișcarea este evident controlată de un computer. În timpul depunerii, sistemul de control al robotului înregistrează automat toate informațiile necesare pentru caracterizarea și identificarea completă a fiecărui punct al matricei. Odată ce sonda se află pe lamelă, are loc procesarea , adică etapa în care sonda este legată covalent de suport printr-o reacție declanșată prin iradiere cu lumină ultravioletă sau prin incubarea lamelei la 80 ° C timp de 2 ore. În cele din urmă, ADNc este realizat cu un singur lanț prin denaturare termică sau chimică. Cu această tehnică, cu toate acestea, a fost posibil să se creeze doar microarrays de densitate mică (adică cu puține sonde pe mm pătrat). Microarrays-urile de ADN pot fi utilizate pentru a detecta ARN-ul care poate sau nu poate fi tradus în proteine. Oamenii de știință numesc această analiză „analiză de expresie” sau profil de expresie . Cu tehnologia microarray puteți obține zeci de mii de rezultate în cel mai scurt timp. Din acest motiv, această tehnologie a permis accelerări semnificative în diverse domenii ale investigației biochimice și biotehnologice.

Utilizarea microarrays-urilor pentru studiul profilului de expresie genică a fost publicată pentru prima dată în 1995 ( Știința ), iar primul genom eucariot completat cu analiza microarrays-ului a fost cel al Saccharomyces cerevisiae în 1997 ( Știința ).

Matrice pentru fotolitografie

În acest caz, oligonucleotidele sunt sintetizate pe loc, această tehnică a fost utilizată pentru prima dată de Affymetrix, care deține brevetul. Tehnica de producere a acestor cipuri se numește fotolitografie, cu ajutorul căreia este posibilă sintetizarea a mii de oligonucleotide diferite pe suprafața unei lame.

Deși această tehnică de sinteză este foarte precisă, lungimea maximă a oligonucleotidelor care poate fi atinsă este de 25 nucleotide, dar oligonucleotidele de această dimensiune nu sunt suficiente pentru a da specificitate microarrayului, pentru aceasta avem nevoie de cel puțin 3 oligonucleotide care leagă o genă și alte 3 oligonucleotide care prezintă o nepotrivire care va servi drept control negativ. Prin urmare, analizele unei singure gene necesită studiul a șase pete care trebuie să conducă la: cele trei oligonucleotide corecte, pozitive, în timp ce cele trei oligonucleotide cu nepotrivirea, negative. Mai mult, de fiecare dată este necesar să se realizeze un cip pentru control și unul pentru subiectul care urmează să fie analizat, deoarece hibridizarea nu poate fi realizată prin concurență. Markerii radioactivi au fost de obicei utilizați pe microarrays cu densitate mică, dar acest tip de markeri nu permite o rezoluție suficient de mare pentru cipurile de densitate mare, cu care este necesar să se utilizeze markeri fluorescenți.

Odată ce microarray-ul a fost construit sau cumpărat și proba de acid nucleic de analizat a fost izolată, are loc reacția de hibridizare, care permite formarea de heteroduplexe. Pentru a obține microarrays bune, este esențial să le protejați de umiditate (dacă mediul este uscat, soluția se evaporă, dacă este umedă, se depune apă) și de praf (fiecare pată este de aproximativ 50 microni mare, un bob de praf și mai mare decât 50 microni, deci poate acoperi diverse pete), din acest motiv există camere speciale pentru hibridizarea microarrays-urilor care sunt sigilate. După hibridizare, microarray-ul este spălat pentru a elimina ADNc care nu s-a legat. În general, ADN-ul fluorescent al probelor experimentale este amestecat cu un ADN al unui subiect martor marcat cu un colorant fluorescent diferit. Pentru microarrays, Cy3 (care emite o lungime de undă în gama verde) și Cy5 (care emite în gama roșie) sunt de obicei utilizate. În acest fel, dacă cantitatea de ARN exprimată de o genă în celulele de interes este crescută (reglată în sus) în comparație cu cea a probei de referință, pata rezultată va fi culoarea primului fluorescent. În schimb, dacă expresia genei este redusă (reglată în jos) în raport cu proba de referință, pata va fi colorată de al doilea fluorescent. Fluorescența este apoi detectată datorită unui scaner laser, datorită căruia se obține o imagine pentru fiecare fluorofor. Apoi se utilizează un software special pentru a converti semnalele într-o gamă de culori în funcție de intensitatea lor. Semnalul detectat de scaner este apoi supus altor algoritmi de filtrare și curățare și transformat în valori numerice. Principala problemă cu microarrays-urile este lipsa standardizării, care provoacă dificultăți în compararea datelor; mai mult, dacă astăzi cu această tehnică este posibil să se analizeze nivelurile de expresie ale unei singure gene obținând rezultate excelente, combinația studiului a multe mii de gene este foarte complicată și poate duce adesea la fals pozitivi, acest lucru se întâmplă și din cauza faptul că unele ADNc pot hibridiza încrucișat alte sonde (care ar fi trebuit să detecteze alte gene). O altă problemă este prezentată de fluorofori, care, deși sunt foarte asemănători unii cu alții, au diferențe problematice. Există o eficiență diferită a fluorescenței între Cy3 și Cy5 care trebuie standardizată de software-ul de detecție, în plus, deoarece Cy3 este mai mic decât Cy5, există un nivel diferit de încorporare a celor doi fluorofori, deoarece polimeraza are mai multe dificultăți în introducerea Cy5- nucleotid marcat datorită obstacolului steric; de parcă acest lucru nu ar fi suficient Cy5 este mai labil decât Cy3, deci o primă scanare a Cy3 cu laserul ar putea reduce fluorescența Cy5. Pentru a depăși toate aceste probleme și pentru a crea un minim de standardizare, se efectuează schimbul de coloranți: constă în efectuarea unui al doilea microarray prin schimbul utilizării fluoroforilor. Dacă în primul microarray Cy3 a fost utilizat pentru a eticheta ADNc experimental, în al doilea microarray Cy3 va fi utilizat pentru a eticheta ADNc al subiectului de control și invers pentru Cy5.

Microarrays pete

În microarrays-urile (sau microarrays cu două canale ), sondele sunt oligonucleotide, ADNc sau fragmente mici produse cu tehnologie PCR corespunzătoare ARNm . Acest tip de microarray exploatează hibridizarea ADN-ului cu ADNc din două probe comparate (de exemplu, pacient și martor), care sunt etichetate cu doi fluorofori diferiți. Probele pot fi amestecate și hibridizate într-un singur microarray și apoi analizate, permițând vizualizarea simultană a genelor reglate în sus și în jos. Cu această tehnică, nivelul absolut al expresiei genelor nu poate fi pe deplin apreciat, dar costul analizei este redus la jumătate.

Microarray de oligonucleotide

Două jetoane Affymetrix

În microarrays-urile oligonucleotidice (sau microarrays-uri cu un singur canal ), sondele sunt concepute pentru a recunoaște porțiuni cunoscute sau prezise ale secvențelor ARNm. Există matrici de microarray ale acestei specii comercializate de numeroase companii specializate precum GE Healthcare , Affymetrix sau Agilent , conțin oligonucleotide importante pentru unele analize de rutină sau chiar părți mari ale genomului diferitelor ființe vii; în plus, matricele ad hoc pot fi produse la cerere pentru a satisface orice nevoie, pentru cercetare sau diagnostic. Tablourile de oligonucleotide pot fi produse fie prin depunere piezoelectrică pe întreaga lungime a oligo, fie prin sinteză in situ (fotolitografie).

Tablourile lungi de oligonucleotide sunt compuse din 60-meruri (oligos constând din 60 de baze) și sunt produse cu tehnologie de imprimare cu jet de cerneală pe substraturi de siliciu. Seturile scurte de oligonucleotide sunt compuse din 25-mers sau 30-mer și sunt produse prin sinteză fotolitografică pe substraturi de siliciu (Affymetrix) sau prin depunere piezoelectrică pe matrice de acrilamide (GE Healthcare). Mai recent, NimbleGen Systems a sintetizat noi matrici, numite Maskless Arrays, care pot fi utilizate flexibil cu numeroase oligonucleotide de testare (sonde): nucleotidele care vor forma oligonucleotidele sunt nucleotide modificate care au o grupă de protecție fotolabilă care, atâta timp cât este în prezent, împiedică legarea acestuia la oligonucleotida în creștere. Acest grup poate fi îndepărtat cu o sursă de lumină care permite nucleotidelor să reacționeze. „Măștile” sunt utilizate pentru a determina ce nucleotide în ce poziție ar trebui să fie activate de lumină. În acest mod, secvențele oligonucleotidice specifice pot fi construite în poziții prestabilite. Această tehnică permite prepararea de microarrays de densitate mare. O matrice standard poate conține mai mult de 390000 godeuri de testare (spoturi). Noi matrici sunt studiate pentru cercetare în domeniul biochimic (căi metabolice) sau pentru diagnostic și prevenire în domeniul medical. În special, această tehnică este importantă pentru analiza genomului subiecților cu boli genetice sau care sunt predispuși la potențiale boli familiale, cum ar fi diabetul, bolile cardiovasculare sau cancerele familiale.

Microarray de genotipuri

Microarrays-urile de ADN pot fi utilizate pentru studiul genotipurilor.

Microarrays-urile SNP sunt microarrays specifice de ADN care sunt utilizate pentru a identifica așa-numitele trăsături hipervariabile, adică acele secvențe care variază de la individ la individ în cadrul aceleiași specii acum sau în subpopulații izolate geografic sau social. Matrice de oligonucleotide scurte sunt utilizate pentru a identifica polimorfismul unei singure nucleotide ( polimorfisme cu nucleotide unice ) (SNP), care sunt considerate responsabile pentru variația genetică și susceptibilitatea individuală la anumite boli manifestate. Microarrays-urile de ADN pot fi utilizate și pentru genotipare ( genotipare ), care este utilizată în medicina legală ( analiza ADN ), în diagnosticare și într-o nouă ramură farmacologică , farmacogenomica , care își propune să studieze relația dintre diversitatea genetică și răspunsul la medicamente, adică atât efecte terapeutice, cât și colaterale sau adverse.

Aceste microarrays SNP sunt utilizate pentru a urmări profilele de mutație somatică în celulele canceroase. Inserarea și deleția la care sunt supuse aceste celule pot fi investigate în același timp cu microarraysul de hibridizare genomică comparativă .

Microarrays și bioinformatică

Standardizare

Lipsa standardizării în matrice prezintă o problemă interoperativă în bioinformatică, care nu poate fi separată de schimbul de date obținut cu această tehnică. Mai multe proiecte open-source își propun să faciliteze schimbul de date obținute din matrice. „Informații minime despre un experiment Microarray” ( MIAME ), standardul XML de bază pentru descrierea experimentelor microarray, a fost adoptat de multe reviste științifice ca standard necesar pentru acceptarea lucrărilor care conțin rezultate obținute prin analiza microarray.

Analiza statistică

Analiza microarray-ului ADN pune o serie de probleme statistice , inclusiv normalizarea datelor.

Analizând metoda microarray, pare evident că numărul mare de gene prezente într-o singură matrice pune experimentatorul în fața unei probleme de testare multiple: chiar dacă este extrem de rară și aleatorie, fiecare genă poate da un rezultat fals pozitiv; un test efectuat pe mai multe gene este mai sigur decât arată o tendință științifică mai convingătoare. O diferență cheie între microarrays și alte metode tradiționale de analiză biomedicală constă în dimensiunea datelor. Studiile care conțin 100 de analize per pacient la 1000 de pacienți pot fi considerate studii clinice mari. Un studiu microarray de dimensiuni medii include câteva mii de date pe eșantion pe sute de eșantioane diferite.

Relația dintre genă și sondă

Relația dintre sondă și ARNm este foarte simplă, dar în același timp complexă. Sonda are o afinitate mare cu o singură secvență (cea complementară), dar poate lega alte secvențe care nu sunt strict complementare. Acest lucru ar putea duce la date incorecte.

Microarray de proteine

Acestea sunt obținute utilizând diferite proteine , fixate pe microarrays, ca sonde. Microarraysurile de proteine sunt utilizate pentru a identifica interacțiunile proteină-proteină sau, de exemplu, pentru a identifica substraturi ale protein kinazelor sau pentru a identifica ținte ale moleculelor mici biologic active.
Cele mai frecvent utilizate proteine în timpul unui microarray de proteine sunt anticorpii monoclonali , în care anticorpii sunt imprimați pe lamă și folosiți ca sonde pentru a detecta proteinele lizate celulare. Cu toate acestea, utilizarea anticorpilor monoclonali creează unele probleme, inclusiv faptul că nu există anticorpi împotriva majorității proteinelor. Mai recent, există o mișcare către alte tipuri de molecule pentru a fi utilizate ca sonde, cum ar fi peptidele mici, medii și mari. Cu toate acestea, anticorpii sunt încă cea mai eficientă sondă pentru microarrays-urile de proteine de astăzi.
Microarraysurile de proteine (numite și biocipuri , chipsuri de proteine ) sunt utilizate în aplicații biomedicale pentru a determina prezența și / sau cantitatea de proteine în probele biologice, de exemplu în sânge. Deși microarraysurile de proteine utilizează metode de detectare similare cu microarrays-urile de ADN, ele prezintă o altă problemă: concentrațiile de proteine dintr-o probă biologică pot fi multe ordine de mărime ale diferenței față de cele ale ARNm. În consecință, metodele de detectare a microarraysurilor proteice trebuie să aibă o gamă mult mai largă de detectare. Cu toate acestea, metoda preferată de detectare este încă cea prin fluorescență, deoarece este sigură, sensibilă și poate oferi rezoluții ridicate.