Stafford a fost angajat de NASA în 1962 ca membru al celui de-al doilea grup de astronauți. La 15 decembrie 1965 a plecat pentru primul său zbor în spațiu ca pilot al misiunii Gemini 6 . Comandantul acestei misiuni era Walter Schirra . Obiectivul misiunii a fost de a efectua o manevră de întâlnire pe orbita Pământului cu capsula Gemini 7 care se afla deja în spațiu.
Al doilea său zbor în spațiu a urmat deja aproximativ șase luni mai târziu. La 3 iunie 1966 a plecat ca comandant al misiunii Gemini 9 împreună cu pilotul Eugene Cernan . În timpul acestei misiuni, întâlnirea a fost efectuată, iar conexiunea a fost încercată cu satelitul lansat anterior în spațiu, ATDA ( Augmented Target Docking Adapter ) - cu toate acestea, ulterior nu a mai fost folosit din nou. Cu toate acestea, această manevră nu a reușit, deoarece o parte a învelișului exterior al satelitului nu s-a desprins complet. Ulterior s-a constatat că acest lucru a fost cauzat de o eroare de asamblare a benzilor de siguranță în timpul asamblării la sol. Această eroare nu a putut fi reparată pe orbita Pământului și, prin urmare, manevra a trebuit abandonată.
În timpul programului Apollo din 1966, Stafford a fost repartizat echipajului de rezervă pentru cel de-al doilea zbor pilotat Apollo, programat să devină un zbor de lungă durată pe orbita Pământului. Datorită catastrofei Apollo 1 , toate deciziile anterioare au fost anulate și Stafford a fost numit pilot de echipaj de rezervă pentru Apollo 7 .
În calitate de comandant, Stafford a plecat spre Lună pe 16 mai 1969 în misiunea Apollo 10 , timp în care modulul lunar (LM) a fost testat pentru prima dată pe orbita lunară . A fost repetiția generală pentru prima aterizare pe lună a luiNeil Armstrong și Edwin Aldrin în iulie același an.
În iulie 1971, a participat, ca reprezentant al Statelor Unite, la înmormântarea cosmonauților sovietici care au murit la întoarcerea Soyuz 11 .
Al patrulea și ultimul său zbor în spațiu a fost misiunea ASTP Apollo-Soyuz din 15 iulie 1975 . În timpul acestui zbor în spațiu, o navă spațială americană (Apollo) a fost legată pentru prima dată de o capsulă sovietică de tip Soyuz 19. După acea misiune, Stafford a părăsit NASA și cariera sa de astronaut.
Cu toate acestea, în iunie 1990 , a fost numit președinte al unui comitet care se ocupă cu evaluarea posibilităților viitoare pentru zborurile spațiale cu echipaj.