Analiza chimiotactică

De la Wikipedia, enciclopedia liberă.
Salt la navigare Salt la căutare

Testele chimiotactice sunt tehnici experimentale pentru a evalua capacitatea chimiotactică a celulelor procariote sau eucariote . O mare varietate de tehnici sunt cunoscute și aplicate în acest scop. Unele sunt tehnici calitative , prin care este posibil să se determine dacă celulele preferă sau nu substanțele chimice testate, alte tehnici sunt cantitative și pot oferi informații despre intensitatea răspunsurilor mai detaliat.

Control de calitate

În general, cea mai importantă cerință de evaluat este calibrarea timpului de incubație a analizei atât pentru celula model, cât și pentru ligant. Un timp de incubație prea scurt nu duce la celule din eșantion, în timp ce un timp prea lung deranjează gradienții de concentrație și măsoară mai multe reacții chimiocinetice decât chimiotactice.

Cele mai frecvent utilizate tehnici sunt grupate în două grupe principale: tehnici cu plăci de agar și două tehnici de cameră.

Tehnici cu plăci de agar

Analiza chimiotactică cu placă de agar

Această metodă de analiză utilizează substraturi semisolide care conțin agar-agar sau gelatină preparate înainte de începerea experimentului. Depresiunile mici sunt sculptate în substrat și umplute cu celule și substanța de testat. Celulele pot migra către gradientul chimic atât în ​​substratul semisolid, cât și sub acel substrat. Unele variații ale tehnicii privesc depresiunile și canalele paralele conectate printr-o tăietură la începutul experimentului (tehnica PP). Aranjamentul radial al tehnicii PP (3 sau mai multe canale) oferă posibilitatea de a compara activitatea chimiotactică a diferitelor populații de celule sau de a studia preferința dintre liganți. [1]

Numărarea celulelor: celulele care răspund pozitiv ar putea fi numărate din partea din față a celulelor migratoare, la microscopul luminos după colorare sau în condiții naturale.


Două tehnici de cameră

Analiza chimiotactică cu tehnică cu două camere

Camerele izolate cu filtru sunt instrumente adecvate pentru determinarea exactă a comportamentului chemotactic. Primul tip al acestor camere a fost construit de Boyden. [2] Celulele mobile sunt plasate în camera superioară, în timp ce cea inferioară este umplută cu fluidul care conține substanța de testat. Mărimea celulelor mobile în studiu determină mărimea porilor filtrului, este esențial să se aleagă un diametru care să permită o trecere activă. Pentru a standardiza condițiile in vivo, diferite protocoale preferă să acopere filtrul cu molecule ale unei matrice extracelulare (colagen, elastină etc.). eficiența măsurătorilor este crescută prin utilizarea de camere cu mai multe godeuri (de exemplu, NeuroProbe), unde 24, 96, 384 de probe sunt evaluate în paralel. Avantajul acestei variante este că mai multe probe în paralel sunt studiate în condiții identice. Într-un alt aparat, camerele sunt conectate una lângă alta orizontal (de exemplu, camera Zigmond) [3] sau ca inele concentrice pe o lamă (de exemplu, camera Dunn). [4] Gradientul de concentrație se dezvoltă pe un pod îngust care leagă camerele, iar numărul de celule migratoare este numărat pe suprafața podului cu un microscop optic. În unele cazuri puntea dintre cele două camere este umplută cu agar și celulele trebuie să „planeze” să alunece în acest strat semi-solid.

Unele tehnici capilare prezintă, de asemenea, o cameră ca supliment, cu toate acestea, există întotdeauna un filtru între celule și substanța studiată. [5] Rezultatele cantitative sunt obținute prin testarea în jgheaburi multiple folosind pipete cu 4-8-12 canale. Precizia pipetei și numărul crescut de probe care rulează în paralel este marele avantaj al acestui test. [6]

Numărarea celulelor: celulele care răspund pozitiv sunt numărate din camera inferioară (timp lung de incubație) sau din filtru (timp scurt de incubație). Pentru recunoașterea celulelor, se utilizează tehnici de colorare (de exemplu, albastru de tripan ) sau teste speciale (de exemplu, detectarea mt-dehidrogenazei cu testul MTT ). De asemenea, sunt utilizate celule marcate (de exemplu fluorocromi), în unele teste celulele sunt etichetate pe măsură ce migrează prin filtru.


Tehnologie de înregistrare micro-video utilizată ca sistem de studio

Analiza chimiotactică cu tehnologie de înregistrare micro-video

Etogramele Tetrahymenei , Euplotes , Oxytricha și altor ciliaturi conțin arcade dreptaci și stângaci, combinate cu segmente drepte și cu diferite tipuri de modificări ale traiectoriei, astfel încât să arate modele locomotorii care determină o mișcare „aleatorie” a exemplarelor studiate. . [7] [8]

Dintre toate trăsăturile comportamentale diferite arcurile, considerate ca segmente de cercuri, constituie elementele de bază. Motivul acestei afirmații este că orice limitare a capacității comportamentale duce la o mișcare circulară pe substrat. Comportamentul a fost înregistrat pe urmele de organisme în mișcare observate în câmpul întunecat și digitalizate în timp real, cu un timp de rezoluție de aproximativ 80 µm. S-a adăugat un studiu al urmelor video (la diferite măriri) de exemplare în mișcare liberă, în care ar putea fi analizate mișcările întregii celule și ale (unei părți a) cirusului. Toate urmele au fost reprezentative pentru cel puțin 20 de exemplare, majoritatea pentru 50 de exemplare.


Alte tehnici

Analiza chimiotactică cu alte tehnici

În plus față de cele două tehnici menționate anterior, care reprezintă cea mai frecvent utilizată familie de tehnici, au fost dezvoltate o gamă largă de protocoale pentru măsurarea activității chimiotactice. Unele sunt doar calitative, cum ar fi testele de agregare , în care bucăți mici de agar sau filtre sunt plasate pe o lamă și se măsoară acumularea de celule în jurul lor.

Într-o altă tehnică semi-cantitativă, celulele sunt acoperite cu substanța testată și modificările în opalescența compartimentului inițial lipsit de celule sunt înregistrate în timpul incubării. [9]

Cea de-a treia tehnică calitativă cea mai frecvent utilizată este însă tehnica labirintului T și aranjamentele sale pentru microplăci. În versiunea originală, un recipient umplut cu celule este perforat și conectat la o supapă. Apoi, supapa este rotită și celulele vin în contact cu alte două recipiente umplute cu substanțe diferite. Incubația este oprită prin restabilirea poziției inițiale a supapei, în timp ce numărul de celule din containere este numărat. [10]

Note bibliografice

  1. ^ (EN) László Köhidai, Method for determine of chemoattraction in Tetrahymena pyriformis , in Current Microbiology, vol. 30, 1995, pp. 251-253, DOI : 10.1007 / BF00293642 .
  2. ^ (EN) Stephen V. Boyden, Efectul chemotactic al amestecurilor de anticorpi și antigen asupra leucocitelor polimorfonucleare , în Journal of Experimental Medicine, vol. 115, 1962, p. 453, DOI : 10.1084 / jem.115.3.453 .
  3. ^ (EN) Sally H. Zigmond, Orientation in chemotaxis chamber , în Methods in Enzymology, vol. 162, 1988, pp. 65-72, DOI : 10.1016 / 0076-6879 (88) 62064-7 .
  4. ^ (EN) Daniel Zicha, Graham A. Dunn și Alastair F. Brown, A new direct-viewing chemotaxis chamber , în Journal of Cell Science, vol. 99, 1991, pp. 769–775.
  5. ^ (EN) Vagn Leick și Jannie Helle, Un test cantitativ pentru chemotaxie ciliate , în Biochimie Analitică, vol. 135, nr. 2, 1983, pp. 466-469, DOI : 10.1016 / 0003-2697 (83) 90713-3 .
  6. ^ (EN) Köhidai László, Éva Lemberkovits și György Csaba, Răspunsuri chemotactice dependente de molecule ale Tetrahymena pyriformis provocate de uleiuri volatile, în Protozoologica Acta, vol. 34, 1995, pp. 181–185.
  7. ^ (EN) Nicola Ricci, Comportamentul protozoarelor ciliate , în Animal Behavior, vol. 40, nr. 6, 1990, pp. 1048-1069, DOI : 10.1016 / S0003-3472 (05) 80172-1 .
  8. ^ (EN) Nicola Ricci, Gabriella Luvera, Manolo Hunters, Rosalba Banquets and Wolfgang Lueken, The effects of 2 mM Hg ++ on the ethogram of Euplotes vannus (Ciliata, Hypotrichida) , in European Journal of Protistology, vol. 33, nr. 1, 1997, pp. 63-71, DOI : 10.1016 / S0932-4739 (97) 80021-1 .
  9. ^ (EN) Uffe Koppelhus, Pentru Hellung-Larsen și Vagn Leick, Un test cantitativ îmbunătățit pentru chemokinezie în Tetrahymena , în The Biological Bulletin, vol. 187, nr. 1, 1994, pp. 8-15, DOI : 10.2307 / 1542160 .
  10. ^ (EN) Judith Van Houten, Elaine Martel și Tonya Kasch,Analiza cinetică a chemokineziei Paramecium , în The Journal of Protozoology, vol. 29, nr. 2, 1982, pp. 226-30, DOI : 10.1111 / j.1550-7408.1982.tb04016.x .

linkuri externe

Biologie Portalul de biologie : Accesați intrările Wikipedia care se ocupă de biologie
Adus de la „ https://it.wikipedia.org/w/index.php?title=Analisi_chemiotattica&oldid=120209829 ”