Fosmide

De la Wikipedia, enciclopedia liberă.
Salt la navigare Salt la căutare

Fosmidele sunt vectori ADN asemănători cu cosmizii, dar pe baza plasmidei bacteriene F. Vectorul de clonare este limitat, deoarece gazda (de obicei E. coli ) poate conține o singură moleculă de fosmid. Fosmidele pot dobândi o inserție de până la 40 kb; adesea sursa inserției este o secvență aleatorie de ADN genomic.

O bibliotecă de fosmide este pregătită prin extragerea ADN-ului genomic din organismul țintă și clonarea acestuia în vectorul fosmid. [1] Amestecul de ligare este apoi ambalat în particule de fagi și prin infecție ADN-ul este introdus în celulele gazdă. Coloniile bacteriene vor propaga biblioteca fosmidelor. Numărul redus de copii pentru fiecare gazdă conferă vectorului o stabilitate mai mare decât chiar și cosmidelor.

Fosmidele sunt utile în special pentru construirea de biblioteci genomice stabile. S-a observat că sunt capabili să mențină ADN-ul uman activ chiar și după 100 de generații de bacterii. [2] Clonele fosmidice au fost utilizate pentru a îmbunătăți acuratețea secvenței genomice umane găsite în Proiectul genomului uman . [3]

Descoperire

Plasmida fertilității sau plasmida F a fost descoperită de Esther Lederberg și codifică informații referitoare la biosinteza pilusului sexual care permite conjugarea bacteriană . Pilusul acționează ca o punte între două celule bacteriene, prin care celulele echipate cu plasmida F (celule F +) transferă o copie monocatenară a plasmidei în sine; în acest fel la sfârșitul procesului ambele celule vor conține o copie a plasmidei F. Celula donatoare păstrează o copie funcțională a plasmidei. Conjugarea favorizată de plasmida F este de asemenea importantă pentru formarea bibliotecilor de fosmide, deoarece ajută la difuzia fosmidei în clonele bacteriene. [4]

Prin urmare, fosmidele sunt vectori ADN care exploatează originea replicării plasmidei F. [5]

Biblioteci ADN

Primul pas către secvențierea unui întreg genom este clonarea acestuia în unități manipulabile de lungimi diferite între 50-200 kb. Utilizarea fosmidelor este ideală datorită stabilității și limitării lor la o singură copie per celulă. Limitarea numărului de plasmide reduce probabilitatea apariției fenomenelor de recombinare, păstrând astfel inserția genomică. [6]

Fosmidele conțin numeroase elemente funcționale:

  • OriT (Transfer Origin): Secvența care indică punctul de plecare al transferului conjugativ.
  • OriV (Originea Replicării): Secvența din care începe replicarea plasmidei în celula destinatară.
  • tra-regiune (gene de transfer): gene care codifică pilonul F și procesul de transfer al ADN-ului.
  • IS (Insertion Elements): numite și „gene egoiste” (fragmente de secvență care vă permit să integrați copiile lor în diferite locații).

Un exemplu de fosmidă mapată poate fi găsit aici: http://what-when-how.com/molecular-biology/f-plasmid-molecular-biology/

A fost îmbunătățită metoda de tăiere și inserare a ADN-ului în vectorii fosmide. În prezent, există multe companii care construiesc o bibliotecă de fosmide din orice eșantion într-o perioadă de timp extrem de scurtă și la un cost relativ scăzut. Această posibilitate le-a permis cercetătorilor să secvențeze numeroase genomuri ale speciilor studiate. Prin diferite metode, mai mult de 6651 genomi au fost complet secvențați și 58,695 sunt în prezent în curs de dezvoltare. [7]

Utilizări

Uneori este dificil să se distingă cu exactitate cromozomii individuali pe baza lungimii lor totale, a diferenței de lungime a celor două brațe și a benzii heterocromatinei. Fosmidele pot fi utilizate ca un marker citologic foarte fiabil pentru a identifica cromozomii unici. Prin intermediul FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) este posibil să se construiască un cariotip metafazic care să permită controlul poziției atribuite inserțiilor de fosmidă. [8]

Sistemul fosmid este extrem de util pentru crearea rapidă a bibliotecilor mini-BAC pentru fiecare cromozom. Avantajul major față de cosmide constă în capacitatea lor de a propaga în mod stabil fragmente de ADN uman. [9] Datorită repetabilității sale ridicate, ADN-ul uman este cunoscut a fi extrem de instabil în sistemele vectoriale cu mai multe copii. S-a observat că stabilitatea crește dramatic atunci când inserțiile sunt prezente în gazdă în exemplare unice. Prin urmare, fosmidele servesc ca substraturi fiabile pentru secvențierea ADN-ului la scară largă.

Instrumente foarte utile, cum ar fi baza de date Nucleotide NCBI , permit cercetătorilor să caute alte biblioteci de fosmide pentru a compara secvențe omoloage între diferite specii.

Notă

  1. ^ Barry G. Hall, Prezicerea evoluției genelor de rezistență la antibiotice. , în Nature Reviews Microbiology , vol. 2, nr. 5, iulie 2004, pp. 430–435, DOI : 10.1038 / nrmicro888 , PMID 15100696 .
  2. ^ H. Shizuya, B. Birren, UJ Kim, V. Mancino, T. Slepak, Y. Tachiiri și M. Simon, Clonarea și întreținerea stabilă a fragmentelor de perechi de 300 kilobase de ADN uman în Escherichia coli folosind un factor F -vector bazat , în Proceedings of the National Academy of Sciences , vol. 89, nr. 18, 15 septembrie 1992, pp. 8794–8797, DOI : 10.1073 / pnas.89.18.8794 , ISSN 0027-8424 ( WC ACNP ) , PMC 50007 , PMID 1528894 .
  3. ^ Ung-Jin Kim, Hiroaki Shizuya, Pieter J. De Jong, Bruce Birren și Melvin I. Simon, Propagarea stabilă a inserțiilor de ADN uman de dimensiuni cosmide într-un vector pe bază de factor F , în Nucleic Acids Res. , Vol. 20, nr. 5, 1992, pp. 1083-1085, DOI : 10.1093 / nar / 20.5.1083 , PMC 312094 , PMID 1549470 .
  4. ^ Robert Bauman,Microbiologie cu boli prin taxonomie , ediția a III-a, Pearson Education Press, 2014, p. 218 .
  5. ^ Ung-Jin Kim, Hiroaki Shizuya, Jesus Sainz, Jeffrey Garnes, Stefan M. Pulst, Pieter De Jong și Melvin I. Simon, Construction and utility of a human chromosome 22-specific Fosmid library , în Genetic Analysis: Biomolecular Engineering , vol. . 12, nr. 2, octombrie 1995, pp. 81-84, DOI : 10.1016 / 1050-3862 (95) 00122-0 .
  6. ^ Gibson, Greg. Muse, Spencer. „Un primer al științei genomului”. A treia editie. Sinauer Associates pp. 84-85
  7. ^ https://gold.jgi-psf.org
  8. ^ Liu, C 2010 Cariotipare în pepene galben (Cucumis melo L.) de către specii încrucișate fluorescență fosmidică in situ Hibridizare, CITOGENETICĂ ȘI CERCETARE GENOMICĂ
  9. ^ B. Tursun, L. Cochella, I. Carrera și O. Hobert,A Toolkit and Robust Pipeline for the Generation of Fosmid-Based Reporter Genes in C. elegans , în PLoS ONE , vol. 4, nr. 3, 2009, p. e4625, DOI : 10.1371 / journal.pone.0004625 , PMC 2649505 , PMID 19259264 .
Adus de la „ https://it.wikipedia.org/w/index.php?title=Fosmidi&oldid=118730204 ”