Jumătate pălărie

Mediul HAT ( hipoxantină - aminopterină - timidină ) este o selecție de medii de cultură pentru liniile celulare de mamifere, care se bazează pe combinația de aminopterină (un compus care acționează ca un inhibitor puternic al metabolismului folatului prin inhibarea activității dihidrofolatului reductazei ) cu hipoxantină ( un derivat purinic ) și timidină (un deoxi nucleozid ), care sunt intermediari în sinteza ADN-ului . Trucul este că aminopterina blochează sinteza de novo a ADN-ului, care este absolut necesară diviziunii celulare , dar hipoxantina și timidina furnizează celulei materialul necesar pentru a ocoli blocul („calea către recuperare”), atâta timp cât există enzime corecte, adică copii funcționale ale genelor care le codifică.

Enzima dihidrofolat reductază , care produce tetrahidrofolat (THF) prin reducerea dihidrofolatului, este blocată în mod specific de aminopterină. THF, acționând în asociere cu proteine ​​specifice, poate primi unități de carbon unice care sunt apoi transferate către ținte specifice.

Una dintre cele mai importante ținte pentru reproducerea celulară este timidilat sintaza , care creează timidină monofosfat (TMP) din deoxiuridină monofosfat (dUMP). Prin reacții suplimentare de fosforilare , TMP poate fi utilizat pentru a produce trifosfat de timidină (TTP), unul dintre cei trei precursori de nucleotide utilizați de ADN polimeraza . Fără THF necesar pentru a converti dUMP, nu poate exista TTP, deci sinteza ADN-ului nu poate continua până când TMP nu este produs dintr-o altă sursă. Sursa alternativă este timidina prezentă în mediul de cultură care poate fi absorbită de celule și fosforilată de timidin kinaza (TK) în TMP.

Sinteza IMP (GMP la GTP și AMP la precursorul ATP) necesită, de asemenea, THF și poate fi ocolită. În acest caz, hipoxantina-guanina fosforibosil transferaza (HGPRT) reacționează cu hipoxantina absorbită din mediul PRPP , eliberând pirofosfat , pentru a produce IMP printr-o cale de reciclare.

Prin urmare, utilizarea mediului HAT pentru culturile de celule este o formă de selecție artificială pentru celulele care conțin TK și HGPRT funcționale. Multe îmbunătățiri utile ale schemei sunt posibile prin otrăvurile care ucid celulele, dar la care sunt imune în absența uneia dintre aceste gene. Astfel, o celulă cu deficit de TK este rezistentă la bromodeoxiuridină (BrdU) în timp ce o celulă cu deficit de HGPRT este rezistentă la 6-tioguanină (6-TG) și 8-azaguanină . Selectarea prin intermediul unuia dintre ultimii doi compuși, urmată de mediul HAT, va duce la colonii revertante . ^[1]

Aplicații

Mediul HAT este adesea utilizat pentru preparatele de anticorpi monoclonali . Acest proces se numește tehnologie hibridoma . Cobaiii de laborator (de exemplu șoareci) sunt mai întâi expuși la un antigen pentru care există interes în izolarea anticorpilor . Odată ce splenocitele sunt izolate de animal, limfocitele B sunt fuzionate cu celulele mielom HPRT negative imortalizate folosind polietilen glicol sau virusul Sendai .

Celulele condensate sunt incubate în mediul HAT . Aminopterina din sol blochează via de novo. Prin urmare, celulele de mielom nefuzate mor, incapabile să producă nucleotide. Limfocitele B nefuzionate, pe de altă parte, mor cu un ciclu de viață mai scurt. În acest fel, supraviețuiesc numai hibrizii mielom-limfocite. Aceste celule produc anticorpi (proprietăți ale limfocitelor B) și sunt nemuritoare (proprietăți ale celulelor mielomului).

Mediul incubat este apoi diluat în plăci succesive la un nivel astfel încât fiecare să conțină o singură celulă. Supernatantul din fiecare va fi utilizat pentru a verifica prezența anticorpului dorit. Deoarece anticorpii dintr-un puț de cultură sunt produși de aceeași celulă B, aceștia vor viza același epitop și sunt cunoscuți ca anticorpi monoclonali . Producția acestuia din urmă a fost inventată de César Milstein și Georges JF Köhler , cărora li s-a acordat Premiul Nobel pentru fiziologie și medicină în 1984, împărțind-o cu Niels Kaj Jerne .

Notă