EcoRV
| Eco RV | |
|---|---|
 | |
| Proteină | |
| PDB | 1AZ0 |
Echo RV (pronunțat: Echo R five ) este o endonuclează de tip 2 izolată din liniile specifice de Escherichia coli . Adesea, enzima este denumită și Eco32I.
În biologia moleculară , EcoRV este o enzimă de restricție frecvent utilizată, capabilă să producă tăieturi orizontale și capete necoezive. Recunoaște secvența palindromică 5'-GAT | ATC-3 ' făcând o tăietură la linia orizontală. Secvența complementară este deci 3'-CTA | TAG-5 ' .
Structura
Structura EcoRV a fost definită prin cristalografie cu raze X , pentru a obține conformația sa în asociere cu secvența țintă. [1]
Interiorul enzimei ( nucleul ) constă dintr-o foaie β compusă din cinci filamente flancate de spirale α. Acest nucleu este conservat în toate endonucleazele de tip 2. De asemenea, are un subdomeniu de dimerizare NTD , format dintr-o helix α scurtă, o foaie cu două filamente antiparalele și o helix α lungă. Acest subdomeniu este prezent doar în EcoRV și PvuII . [2]
Mecanism de acțiune
La fel ca EcoRI , EcoRV formează, de asemenea, un homodimer în soluție înainte de legarea și tăierea secvenței sale specifice de ADN. [3] La început, enzima se leagă slab de un situs ADN nespecific, apoi se deplasează aleator de-a lungul ADN-ului în căutarea sitului, [2] pe care îl recunoaște cu o specificitate extremă.
Legarea acestei enzime induce o schimbare conformațională a ADN-ului, determinând îndoirea acestuia cu aproximativ 50 °. Efectul acestei plieri este o accesibilitate mai mare a sulcusului minor și o compresie a celui major , cu consecințe asupra legăturii fosfodiesterice , care este adusă mai aproape de locul activ al enzimei și tăiată. Prin urmare, tăierea nu necesită prezența ATP . [2] EcoRV este singura enzimă de restricție cunoscută pentru a genera o schimbare conformațională a ADN-ului acestei entități. [2]
Utilizări
EcoRV, este adesea utilizat în soluție în ser bovin albuminic , pentru a opera o subclonare , adică prin inserarea unui fragment din gena de interes într-un vector, cum ar fi o plasmidă .
Notă
- ^ Structura cristalină a EcoRV: cod PDB [1] .
- ^ a b c d Pingoud A, Jeltsch A, Structura și funcțiile endonucleazelor de restricție de tip II , în Nucleic Acids Research , vol. 29, nr. 18, 2001, pp. 3705-3727, PMID 11557805 .
- ^ Bitinaite J, Wah DA, Aggarwal AK, Schildkraut I, Structure FokI dimerization is required for DNA cleavage , in Proc Natl Acad Sci USA , vol. 95, nr. 18, 1998, pp. 10570-10575, PMID 9724744 .
Elemente conexe
- EcoRI , o altă enzimă de restricție din Escherichia coli .