Deoxiribonucleaza II (specific sitului)

dezoxiribonucleaza II (specific sitului)
Model tridimensional al enzimei
Numărul CE	3.1.21.4
Clasă	Hidrolaza
Numele sistematic
dezoxiribonucleaza specifică site-ului II
Alte nume
enzima de restricție de tip II
Baze de date	BRENDA , EXPASY , GTD , PPB ( RCSB PPB PDBe PDBj PDBsum )
Sursa:IUBMB
Editați datele pe Wikidata · Manual

Deoxiribonucleaze II (specifice site-ului) (cunoscute de obicei sub numele de enzime de restricție ) sunt o clasă de enzime , aparținând clasei hidrolazelor , care catalizează scindarea endonucleolitică a ADN-ului pentru a da fragmente specifice dublu catenare cu fosfați terminali la 5 '.

Aceste complexe proteice sunt capabile să rupă legăturile fosfodiesterice ale ADN - ului cu dublă catenă. Rolul biologic al acestor enzime este de a proteja și proteja celula: în procariote aceste enzime sunt esențiale pentru tăierea și degradarea filamentelor străine genomului (cum ar fi cel care provine dintr-o infecție cu fagi ). Enzimele de restricție sunt capabile să distingă firele străine deoarece ADN-ul bacterian, în corespondență cu secvențele recunoscute de enzimele de restricție, este metilat . ^[1]

Descoperirea enzimelor de restricție se datorează lui Werner Arber , un microbiolog elvețian, împreună cu Daniel Nathans și Hamilton Smith . În 1978, cei trei au primit Premiul Nobel pentru Medicină „pentru descoperirea enzimelor de restricție și aplicarea lor la problemele de genetică moleculară”.

Clase de enzime de restricție

Enzimele de restricție sunt împărțite în trei categorii: endonucleaze de tip I, II, III.

Endonucleazele de tip I ( numărul CE 3.1.21.3 ^[2] ) și III ( numărul CE 3.1.21.5 ^[3] ) necesită ATP ca o coenzimă pentru scindare și pot cataliza, de asemenea, reacții de modificare a ADN-ului, cum ar fi metilarea (adăugarea de grupări metil cu baze specifice ). Sunt asociate reacții la nucleoză și metilază. În timp ce endonucleazele de tip I efectuează hidroliza ADN-ului în puncte aleatorii, chiar la mai mult de 1000 bp distanță de situl de recunoaștere, endonucleazele de tip III recunosc situsul țintă și se taie aproape de acesta, aproximativ 24-26 bp din secvența consens.

O discuție separată trebuie făcută pentru endonucleaze de tip II, enzimele de restricție reale, cele utilizate în laborator. Aceste enzime, de fapt, nu necesită ATP pentru funcția lor și tăierea are loc în corespondență cu secvențe foarte specifice. Ei au, de asemenea, activitate neasociată de nuclează și metilază.

Secvențe recunoscute

Fiecare enzimă de clasa II are propria sa secvență țintă (numită și secvență consens ), pe care o recunoaște și o taie. Această secvență, de obicei 4-8 perechi de baze, se numește situs de restricție și permite tăierea ADN-ului la acel sit. Acestea sunt site-uri cu secvențe palindromice : dacă sunt citite în conformitate cu aceeași polaritate, acestea sunt identice în cele două filamente (de exemplu, 5 '... GATC ... 3' este palindromic deoarece complementul său este 3 '... CTAG ... 5 ', care se citește de la 5' la 3 'corespunde GATC). O consecință a acestui fapt este că enzima de restricție este un dimer, mai precis un homodimer , deoarece trebuie să recunoască aceeași secvență pe ambele catene. Unele enzime (numite rare ) au situri de tăiere care nu sunt foarte prezente în genom (acestea sunt cele cu cele mai lungi secvențe). Altele, precum EcoRI, BamHI și HindIII, printre cele mai utilizate, au site-uri de tăiere mult mai frecvente.

Sunt posibile două tipuri de tăieturi: tăierea offset și tăierea orizontală .

• Tăierea eșalonată . Un exemplu ar putea fi tăierea făcută de enzima de restricție E. coli EcoRI . Secvența consens a acestei endonucleaze este:

 5 '... GAATTC ... 3'
     ||||||
3 '... CTTAAG ... 5'

Enzima EcoRI produce o tăietură eșalonată prin crearea a două capete (numite capete coezive sau lipicioase ) cu un singur filament la 5 ':

 5 '... G AATTC ... 3'
     | |
3 '... CTTAA G ... 5'

Capetele coezive (adică „lipicioase”) care au fost create se pot împerechea cu secvențe complementare.

• Tăierea orizontală . Exemplul acestui tip de tăietură este enzima SmaI:

 5 '... CCCGGG ... 3'
     ||||||
3 '... GGGCCC ... 5'

Tăierea SmaI nu produce capete coezive, ci capete contondente :

 5 '... CCC DD ... 3'
     ||| |||
3 '... DD CCC ... 5'

Aplicații

Enzimele de restricție de clasa II sunt utilizate în aplicații biotehnologice. De exemplu, în tehnologia ADN-ului recombinant, enzimele de restricție de clasa II sunt utilizate pentru clonarea moleculară, care constă în introducerea unei gene de interes într-o moleculă de ADN numită plasmidă, capabilă să se replice într-un sistem gazdă., Adesea bacteriană, pentru a produce cantități mari de genă sau pentru a permite exprimarea acesteia.

Pentru ca gena să fie inserată, atât ADN-ul genei cât și plasmida sunt tratate cu aceeași enzimă de restricție: la sfârșitul reacției, atât plasmida, cât și gena vor avea capete terminale similare. În special, dacă enzima utilizată produce o tăietură eșalonată, capetele de coeziune produse vor tinde să se asocieze în prezența enzimei ADN ligază, care catalizează reacția de ligare.

O altă aplicație practică constă în analiza, de exemplu, în medicina criminalistică , RFLP ( polimorfisme de lungime a fragmentelor de restricție). Când un situs polimorf , care conține o secvență consensuală pentru o enzimă de restricție, este mutat , este posibil să se observe diferențial activitatea de scindare a enzimei în sine. Dacă nu se observă nicio tăietură, va exista o mutație pe locul specific al enzimei. În caz contrar, tăierea are loc, site-ul specific va fi intact și nu va fi modificat.

Prin urmare, enzimele de restricție sunt utilizate pe scară largă în ribotipare .

Exemple

 5'GAATTC
3'CTTAAG

5 '--- G AATTC --- 3'
3 '--- CTTAA G --- 5'

 5'GATATC
3'CTATAG

5 '--- GAT ATC --- 3'
3 '--- CTA TAG --- 5'

 5'GGATCC
3 'CCTAGG

5 '--- G GATCC --- 3'
3 '--- CCTAG G --- 5'

 5'AAGCTT
3'TTCGAA

5 '--- A AGCTT --- 3'
3 '--- TTCGA A --- 5'

 5'CCTNAGG
3'GGANTCC

 5'TCGA
3'AGCT

5 '--- T CGA --- 3'
3 '--- AGC T --- 5'

 5'GCGGCCGC
3'CGCCGGCG

 5 'GANTC
3'CTNAG

 5'AGCT
3'TCGA

5 '--- AG CT --- 3'
3 '--- TC GA --- 5'

Notă

Bibliografie

• (EN) Roberts, enzimele de restricție RJ și izoschizomerii lor. Nucleic Acids Res. 18 (1990) 2331–2365. Entrez PubMed 2159140

Alte proiecte

• Wikimedia Commons conține imagini sau alte fișiere pe Restriction Enzyme

linkuri externe

• ( EN ) Autobiografia lui Werner Arber , pe nobel.se .
• ( EN ) Restriction Enzyme Database (REBASE) , pe rebase.neb.com .

V · D · M Biologie moleculara
Dogma centrală a biologiei moleculare
Expresia genelor	Procese Replicare · Transcriere · Traducere Elemente Polimerază ( ADN polimerază · ARN polimerază ) · promotor · Intron · Exon · Terminator Reglarea genelor Enhancer · cutie TATA · Repressor · Operon · Regulon
Sinteza proteinei	ARNm · ARNt · Ribozom · Împletire · Modificare post-translațională
Tehnici	BioBrick · Clonare · PCR · electroforeză pe gel de agaroză · Electroforeză pe gel de poliacrilamidă · Southern blot · Northern blot · Western blot · Secvențiere · secvențierea ADN

Portalul de biologie : accesați intrările Wikipedia care se ocupă de biologie