Secvențierea
Termenul secvențial, în biologia moleculară , indică procesul de determinare a structurii primare exacte a unui polimer organic, și anume, ordinea bazelor în cazul unui acid nucleic sau aminoacizilor în cazul proteinelor , care reprezintă structuri secvențiate în principal.
Secvențierea ADN-ului
Secvențierea ADN- ului este un proces care servește la alinierea bazelor ( adenină , citozină , guanină și timină ) care alcătuiesc fragmentul de ADN analizat, astfel încât să poată fi citit și analizat în mod corespunzător. Secvența ADN conține toate informațiile genetice ereditare care stau la baza dezvoltării tuturor organismelor vii.
În cadrul acestei secvențe, genele fiecărui organism viu sunt codificate, precum și instrucțiunile pentru exprimarea lor în timp și spațiu (reglarea expresiei genelor ). Prin urmare, determinarea secvenței este utilă în cercetarea de ce și cum trăiesc organismele. Există porțiuni de ADN ale căror funcții le cunoaștem deja, odată ce ADN-ul fragmentului analizat a fost secvențiat este posibil să-l comparăm cu secvențele deja catalogate stocate în baze de date online, dar semnificația majorității genomului uman nu este încă cunoscut.
Cunoașterea genomului este, prin urmare, utilă în orice domeniu al biologiei, iar apariția metodelor pentru secvențierea ADN a accelerat semnificativ cercetarea. În medicină , de exemplu, secvențierea este utilizată pentru a identifica și diagnostica bolile moștenite și pentru a dezvolta noi tratamente. În mod similar, genomul agenților patogeni poate duce la dezvoltarea de medicamente împotriva bolilor contagioase. Mai mult, viteza procesului de secvențiere de astăzi a fost de mare ajutor pentru secvențierea pe scară largă a genomului uman . De asemenea, secvențierea genomului diferitelor organisme animale și vegetale, precum și a multor microorganisme, a fost finalizată.
Determinarea secvențelor ADN s-a dovedit, de asemenea, utilă în diferite domenii de aplicare, cum ar fi științele criminalistice și ale alimentelor.
Metoda utilizată în principal până acum se bazează pe metoda de terminare a lanțului dezvoltată de Frederick Sanger . Această tehnică se bazează pe utilizarea nucleotidelor modificate (dideoxi trifosfat, ddNTP) pentru a opri reacția de sinteză în poziții specifice de-a lungul secvenței. Secvențierea utilizând așa-numita metodă Sanger are ca rezultat în zilele noastre capacitatea de a secvența fragmente de până la 1000 de baze, iar automatizarea a făcut posibilă efectuarea a 384 de reacții în paralel în același timp.
În ultimii ani, totuși, au fost dezvoltate noi metode numite secvențializare de paralelism ridicat , capabile să producă cantități enorme de secvențe de lungime mai mică decât metoda Sanger, dar la un cost mai mic și mai ales la o viteză mai mare. Se estimează că într-o cursă de 454 (o metodă cu un randament ridicat care utilizează piroseqüențierea ) se pot obține până la 20 de milioane de baze pe parcurs [1] . Din acest motiv, noile metode cu randament ridicat câștigă teren pe piața secvențierii.
Tehnici
Au fost concepute mai multe strategii pentru a obține secvența de nucleotide ADN. Printre acestea se numără metoda chimică concepută de Allan Maxam și Walter Gilbert , utilizată acum doar în cazuri particulare datorită toxicității mari a reactivilor necesari acestei tehnici și metoda enzimatică, încă foarte răspândită, concepută de Frederick Sanger , care a primit al doilea Premiu Nobel. Până în prezent, majoritatea secvențierii au fost realizate datorită metodei de terminare a secvenței dezvoltată de Sanger.
Metoda Sanger
Metoda dezvoltată de Frederick Sanger și colegii săi (așa-numita metodă de terminare a lanțului , metoda de terminare a lanțului sau metoda Sanger, de la numele descoperitorului său) [2] [3] , este o așa-numită metodă enzimatică , deoarece necesită utilizarea unei enzime ; principiul tehnicii dezvoltate de Fred Sanger se bazează pe utilizarea nucleotidelor modificate (dideoxi trifosfat, ddNTP) pentru a opri reacția de sinteză în poziții specifice.
În reacția de secvențiere, extensia este inițiată la un loc specific al ADN-ului folosind un primer oligonucleotidic complementar regiunii ADN și are loc printr-o ADN polimerază care utilizează cele patru deoxinucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Împreună cu acestea, se introduc dideoxinucleotide care, odată încorporate de ADN polimeraza în sinteza catenei, provoacă blocarea acesteia. Prin introducerea acestor „blocanți” în cantități mici, veți avea o serie de fire de lungimi diferite, în funcție de locul în care au fost încorporați acești blocanți. Aceste ddNTP-uri sunt, de obicei, etichetate ( radioactiv sau prin fluorescență ), astfel încât să poată fi vizualizate ulterior. O altă posibilitate este de a marca grundul, chiar dacă această practică a căzut acum în uz.
Fragmentele sunt apoi separate în funcție de lungimea lor pe un gel, se utilizează gelul de agaroză care ne permite să separăm fragmentele care diferă în lungime chiar și pentru o singură bază (sau altă matrice polimerică ), apoi sunt afișate pe o placă fotografică sau pe gel (în funcție de tipul de marcare). În imaginea opusă ddNTP-urilor au fost etichetate radioactiv și benzile întunecate corespund diferitelor fragmente de lungime diferită. Pozițiile relative ale benzilor din cele patru benzi sunt utilizate pentru a citi secvența (de jos în sus).
Pirosequencing
Piroseqüențierea este una dintre noile tehnici de secvențiere foarte paralele, bazate pe principiul „secvențierii prin sinteză”; dezvoltat de Mostafa Ronaghi, a fost descris pentru prima dată în 1998 [4] [5] [6] . Această tehnică se bazează pe utilizarea unei serii de enzime care produc lumină în prezența ATP atunci când o nucleotidă este încorporată în catena (de ADN polimerază).
Piroza secvențierea constă din 5 pași principali:
1. Secvența de analizat, după ce a fost amplificată prin PCR, este incubată ca o singură helix împreună cu enzimele ADN polimerază, ATP sulforilază, luciferază și pirază și cu substratele adenozin sulfosfat (ASP) și luciferină;
2. La reacție se adaugă unul dintre cele patru dNTP-uri. ADN polimeraza catalizează adăugarea acestei baze numai dacă este complementară cu reziduul șablon. În acest caz există eliberare concomitentă de pirofosfat anorganic PPi;
3. PPi astfel produs este transformat în ATP, prin sulforilază și folosind ASP ca substrat. ATP obținut permite conversia luciferinei în oxiluciferină de către luciferază cu producerea unui semnal luminos care este detectat de o cameră CCD fotosensibilă specială. Incorporarea nucleotidelor în catenă generează o cantitate de lumină care este proporțională cu numărul de baze încorporate într-o singură adăugare de nucleotide (de exemplu, în cazul unei secvențe homopolimerice de tip AAA, TTT, GGG sau CCC, cantitatea de lumină eliberată este proporțional cu numărul de nucleotide încorporate, în acest caz 3);
4. Enzima apirază degradează dNTP care nu a fost încorporat și ATP produs de sulforilază. Numai când degradarea este terminată, se adaugă un al doilea dNTP pentru a avansa reacția de polimerizare (revenind la pasul 1);
5. Toate cele 4 nucleotide sunt adăugate ciclic până la deducerea completă a secvenței.
Videoclip explicativ despre Pirosequencing
454 / Secvențierea Roche
Secvențierea 454 a fost prima metodă de secvențiere de generație următoare care a ieșit pe piață (2007). Cu această metodă, secvențierea poate fi efectuată pornind de la diferite tipuri de acid nucleic: ADN genomic, ADN produs cu PCR, ADNc sau BAC. Probele care trebuie secvențiate sunt mai întâi reduse, prin nebulizare, în fragmente mai mici de 300 -800 bp .
Ulterior fragmentele sunt transferate în nano-sfere, imobilizate pe o lamă. Doar un fragment de ADN este legat de fiecare particulă și unirea nu este covalentă. Secvențierea are loc paralel cu formarea lanțului complementar, de către ADN polimeraza. Fiecare fragment este legat de secvențe terminale complementare primerilor, necesare în faza de amplificare ulterioară.
Inovația sistemului 454-Roche constă în faptul că, cu această tehnică, nu mai sunt folosiți nucleotide fluorescente, ci folosește pirofosfat anorganic (PPi), un produs rezidual al ADN polimerazei. Pirofosfatul anorganic este substratul enzimei sulfurilazei care produce ATP din PPi și AMP. La rândul său, ATP este preluat de luceferază, care îl folosește pentru a oxida luciferina. Datorită acestei ultime reacții, se produce un semnal luminos. Nucleotidele sunt adăugate pe rând, tocmai pentru că fluorescența este aceeași pentru fiecare dintre ele.
Semnalul este detectat de un fotodetector și este posibilă citirea secvenței prin intermediul unui grafic. Există și alte tehnologii de neosevenție, cum ar fi ABI / Solid și Illumina. Ion Torrent și metoda Oxford Nanopore aparțin secvențierelor de a treia generație. De-a lungul anilor, datorită inovațiilor continue în acest domeniu, noi aspecte ale genomului nostru sunt descoperite continuu și nu numai.
Secvențierea ARN
ARN-ul este generat în transcriere din ADN , iar informațiile pe care le transportă sunt deja incluse în genomul celulei . Cu toate acestea, în unele circumstanțe este util să se secvențeze molecule de ARN. ARN-ul eucariot nu se potrivește cu ADN-ul din care este fabricat deoarece intronii sunt îndepărtați. Secvențierea începe cu transcrierea inversă pentru a crea un fragment de ADN, care este apoi secvențiat așa cum este descris mai sus. Cel mai important moment în secvențierea ARN s-a produs înainte de descoperirea ADN-ului recombinant și a fost secvențierea primei gene - și apoi a întregului genom al bacteriofagului MS2 - între 1972 și 1976 de Walter Fiers și colaboratorii de la Universitatea din Gent [7] [ 8] .
Secvențierea proteinelor
Metodele pentru secvențierea proteinelor includ:
- Degradare Edman
- Amprentarea proteinelor
- Spectrometrie de masa
- Digestie prin protează
Deoarece secvențierea proteinelor este un proces mai complex, este mai ușor să se deducă secvența proteinei din gena care o codifică, dacă este disponibilă; determinarea cel puțin o parte din aminoacizi secvență ( de obicei un capăt) cu una dintre metodele enumerate mai sus este de obicei suficient pentru a proceda la identificarea unei clone care codifică pentru gena respectivă.
Secvențierea polizaharidelor
Deși polizaharidele sunt, de asemenea, din polimeri organici, secvențierea lor nu este comună din mai multe motive.
De fapt, deși multe polizaharide sunt liniare (de exemplu celuloză ), multe sunt ramificate (de exemplu glicogen ). Mai mult, unii polimeri pot conține diferite tipuri de monomeri, iar legăturile chimice care le leagă pot fi diferite. Cu toate acestea, cel mai important motiv care face dificilă secvențierea acestor polimeri este că, în timp ce în cazul proteinelor și acizilor nucleici, polimerizarea este ghidată de un șablon (ADN sau ARNm) și cauzată de o singură enzimă, în cazul polizaharidelor, adunarea nu are reguli atât de stricte. În funcție de enzima care operează procesul de polimerizare, pot fi încorporați unul sau mai mulți monomeri diferiți, ceea ce poate da naștere la diferite familii de molecule similare. Acest lucru este valabil mai ales în cazul polizaharidelor vegetale. Metodele pentru determinarea structurii oligozaharidelor și polizaharidelor includ RMN și analiza metilării [9] .
Notă
- ^ Copie arhivată , la 454.com . Adus la 7 iunie 2008 (arhivat din original la 5 iulie 2008) .
- ^(EN) Sanger F, Coulson AR. O metodă rapidă pentru determinarea secvențelor în ADN prin sinteză amorsată cu ADN polimerază. J Mol Biol. 1975 25 mai; 94 (3): 441-448
- ^(EN) F. Sanger, S. Nicklen și AR Coulson, secvențierea ADN-ului cu inhibitori de terminare a lanțului, Proc Natl Acad Sci US A. 1977 decembrie; 74 (12): 5463–5467
- ^(EN) Ronaghi și colab. , O metodă de secvențiere bazată pe pirofosfat în timp real , în Știința , vol. 281, 17 iulie 1998, p. 363, DOI : 10.1126 / science.281.5375.363 , PMID 9705713 .
- ^(EN) Ronaghi și colab. , Secvențierea ADN în timp real utilizând detectarea eliberării pirofosfatului , în Biochimie Analitică , vol. 242, 1996, p. 84–89, DOI : 10.1006 / abio.1996.0432 , PMID 8923969 .
- ^(EN) Nyrén, P., The History of Pyrosequencing, în Methods Mol Biology, vol. 373, 2007, pp. 1-14, PMID 17185753 .
- ^(EN) Min Jou W, G Haegeman, Ysebaert M, Fiers W., Secvența nucleotidică a genei care codifică proteina de acoperire a bacteriofagului MS2, Nature. 1972 12 mai; 237 (5350): 82-8
- ^(EN) Secvența nucleotidică completă a ARN-ului bacteriofag MS2: structură primară și secundară a genei replicazei. Natura . 8 aprilie 1976; 260 (5551): 500-7.
- ^ (EN) Un ghid practic pentru analiza structurală a glucidelor , pe stenutz.eu.
