Mcherry

De la Wikipedia, enciclopedia liberă.
Salt la navigare Salt la căutare

mCherry este un membru al familiei mFruits sau proteine ​​fluorescente roșii monomerice (mRFP). Fiind un RFP, derivă din DsRed de anemone de mare Discosoma , spre deosebire de proteinele fluorescente verzi (GFPs), care sunt de multe ori derivate din meduze Aequoera victoria [1] . Trace componentele într - o celulă , astfel încât acestea să poată fi studiate folosind tehnica spectroscopiei fluorescentei. mCherry are un spectru de absorbție între 540-590 nm, în timp ce spectrul de emisii este inclus în intervalul cuprins între 550-650 nm. [2] mCherry aparține grupului de fluorescență al cromoforilor al cromoforilor și este folosit ca un instrument important pentru vizualizarea genelor și, astfel, pentru a analiza funcțiile acestora în experimente. O îmbunătățire semnificativă a tehnicilor de editare a genomului a fost observată prin inserarea precisă a acestor etichete de proteine ​​fluorescente în materialul genetic al multor organisme diferite. Majoritatea comparațiilor dintre luminozitatea și fotostabilitatea diferitelor proteine ​​de fluorescență au fost făcute in vitro , eliminate din variabilele biologice care influențează performanța proteinelor din celule sau organisme [3] Este dificil să simulăm perfect mediul celular in vitro și diferența dintre acestea din urmă ar putea avea un efect atât asupra luminozității, cât și asupra fotostabilității. MRFP, cum ar fi mCherry, se dovedesc a fi foarte utile deoarece posedă o greutate moleculară mică și au un proces de pliere mai rapid decât tetramerii. Acest lucru se reflectă în faptul că proteinele monomerice fluorescente perturbă mai puțin sistemul țintă.

Dezvoltare

DsRed este izolat de anemona de mare Discozom și este o proteină tetramerică . [1] Majoritatea proteinelor fluorescente roșii provin din DsRed. DsRed are fotostabilitate scăzută (rezistența la schimbare sub influența energiei radiante sau a luminii) și o rată lentă de maturare (timp în care jumătate din proteină este pliată). mRFP1 provine de la DsRed și este un monomer, deci este mai mic, dar randamentul său cuantic și fotosensibilitatea sunt mai mici comparativ cu DsRed [1] . MFructele în general au fost dezvoltate deoarece, în timp ce diferite proteine ​​colorate pot fi găsite din alte antozoice , proteinele care pot fi în mare parte tetrameri pot întâmpina aceleași probleme ca și DsRed. Acești tetrameri pot necesita derivări precum cele prezente de la DsRed pentru a le face parteneri utili de fuziune. [1] Cu toate acestea, mCherry are un randament cuantic mai mic decât mRFP1 [1]

Structura proteică a mCherry. ID PDB: 2H5Q

Structura

Gena mCherry are o lungime de 711 pb [4], iar proteina este alcătuită din 236 reziduuri cu o masă de 26.722 kDa. [5] Structura cristalină a mCherry a fost determinată în 2006. [6] Conține 3 spirale alfa și 13 foi beta care alcătuiesc barilul beta . Cromoforul din mCherry este compus din cei trei aminoacizi metionină , tirozină și glicină , care sunt modificați post-translațional într-o imidazolinonă. [1] Numărul acestor reziduuri este de 66, 67 și respectiv 68. Conjugarea pi-electronică conferă mCherry absorbanța și emisia sa pe spectrul roșu. [7] Această structură este aproape identică cu structura terțiară a DsRed, de asemenea un baril beta de 11 subunități și este similară cu structura terțiară a GFP. [8] Acest lucru face ca mediul din jurul cromoforului din mCherry să fie mai hidrofob decât cel din jurul DsRed. [9] Capătul terminalului în mCherry este similar cu GFP, permițându-i să fie încorporat în sistemul în care GFP poate fi utilizat în timp ce mRFP nu ar putea. [1]

Utilizări

mCherry este utilizat în microscopia cu fluorescență ca sondă intracelulară [10] Cu toate acestea, atunci când o proteină este marcată prin fuziune cu o proteină de fluorescență, interacțiunile dintre ele pot perturba nedorit direcționarea sau funcționarea. [1]

Utilizarea mCherry este utilizată acolo unde se dorește exprimarea genelor constitutive, iar alte abordări experimentale necesită control coordonat al mai multor gene. Deoarece utilizarea multor tehnici a fost studiată în mod specific în E. coli și alte modele, utilitatea și funcționalitatea acestor tehnici nu se împrumută altor specii. De exemplu, pentru agentul patogen Gram negativ, Legionella pneumophila , un vector pentru Legionella , sistemul P tac reprezintă singurul sistem de control pentru o expresie optimă. Pentru a crește disponibilitatea instrumentelor pentru studierea expresiei genice a bacteriei L. pneumophila , mCherry a fost studiat, care conferă expresia genetică constitutivă dintr-un situs de legare LacI mutagenizat. mCherry nu interferează cu alte plasmide care găzduiesc un sistem de expresie tac LacI-P și nici nu modifică creșterea speciilor de Legionella în timpul creșterii intracelulare. Structura plasmidică cu o gamă largă de gazde mCherry a permis exprimarea genetică constitutivă într-o mare varietate de specii bacteriene Gram-negative, făcând mCherry un instrument util pentru o comunitate de cercetare mai mare. [11]

Poate fi folosit și ca acceptor al unui hetero-FRET (transfer de energie rezonantă la fluorescență) cu o lungime de undă extinsă și poate fi o sondă pentru experimentele homo-FRET. [12] FRET este un tip de transfer de energie fluorescentă în care nu există foton intermediar și a cărui energie este transferată de la un donator la un acceptor - așa cum se obișnuiește etichetarea bacteriilor pentru vizualizare fără selecția antibioticelor. [13]

Alte RFP-uri și mFruits

RFP original: DsRed

RFP-uri de primă generație: mRFP1

RFP-uri de a doua generație: mStrawberry, mOrange, dTomato

MFruits sunt proteine ​​monomerice de fluorescență roșie de a doua generație (mRFP) a căror luminozitate și fotostabilitate sunt semnificativ îmbunătățite în comparație cu mRFP1 din prima generație. Lungimile lor de undă de emisie și excitație sunt distribuite într-un interval de aproximativ 550-650 și respectiv 540-590 nm. Cu toate acestea, variațiile spectrelor lor pot fi urmărite înapoi la câțiva aminoacizi. Analizele de spectroscopie și rezoluție cristalografică atomică ale celor trei mFRtuis reprezentative, mOrange, mStrawberry și mCherry relevă faptul că mecanisme diferite funcționează pentru a determina excitația și emisia maximă. Trecând la o a doua etapă de oxidare, fiecare mFruit produce o legătură acilimină în lanțul principal al polipeptidei. În comparație cu progenitorul DsRed, o modificare covalentă directă a acestei legături (mOrange) și o modificare indirectă a mediului cromofor (mStrawberry și mCherry) produc variante puternice deplasate în spectrul albastru și roșu. Schimbarea în albastrul mOrange este indusă de o modificare covalentă a lanțului său principal de proteine.

Harta densității electronilor indică formarea unui al treilea heterociclu, 2-hidroxi-dihidrooxazol, prin reacția treoninei 66 Oγ cu lanțul polipeptidic, care la rândul său reduce conjugarea grupării carbonil în poziția 65 cu restul cromoforului. În mStrawberry și mCherry, mișcarea lizinei încărcate 70 și protonația acidului glutamic 215 s ar trebui să modifice distribuția densității electronilor, inducând schimbarea distinctivă a roșu. [2]

Notă

  1. ^ a b c d e f g h ( EN ) Nathan C Shaner, Robert E Campbell, Paul A Steinbach, Ben NG Giepmans, Amy E Palmer și Roger Y Tsien, Proteine ​​monomerice fluorescente roșii, portocalii și galbene derivate din Discosoma sp. proteină fluorescentă roșie , în Nature Biotechnology , vol. 22, n. 12, 21 noiembrie 2004, pp. 1567–1572, DOI : 10.1038 / nbt1037 , ISSN 1087-0156 ( WC ACNP ) , PMID 15558047 .
  2. ^ a b ( EN ) Xiaokun Shu, Nathan C. Shaner, Corinne A. Yarbrough, Roger Y. Tsien și S. James Remington, Novel Chromophores and Buried Charges Control Color in mFruits †, ‡ , în Biochimie , vol. 45, n. 32, august 2006, pp. 9639–9647, DOI : 10.1021 / bi060773l , ISSN 0006-2960 ( WC ACNP ) , PMID 16893165 .
  3. ^ Jennifer K. Heppert, Daniel J. Dickinson, Ariel M. Pani, Christopher D. Higgins, Annette Steward, Julie Ahringer, Jeffrey R. Kuhn și Bob Goldstein,Evaluarea comparativă a proteinelor fluorescente pentru imagini in vivo într-un sistem model animal , în Biologia moleculară a celulei , vol. 27, n. 22, 7 noiembrie 2016, pp. 3385–3394, DOI : 10.1091 / mbc.e16-01-0063 , ISSN 1059-1524 ( WC ACNP ) , PMC 5221575 , PMID 27385332 .
  4. ^ (EN) Addgene - Analyze Sequence , pe www.addgene.org. Adus la 11 noiembrie 2018 .
  5. ^ (EN) mCherry - proteină fluorescentă mCherry - marginală Anaplasma - genă și proteină mCherry , pe www.uniprot.org. Adus la 11 noiembrie 2018 .
  6. ^ (EN) X. Shu și SJ Remington, Structura cristalină a mCherry pe www.rcsb.org, 22 august 2006, DOI : 10.2210 / pdb2h5q / pdb . Adus la 11 noiembrie 2018 .
  7. ^ Atsushi Miyawaki, Daria M Shcherbakova și Vladislav V Verkhusha,Red fluorescent protein: chromophoreformation and cellular applications , în Current Opinion in Structural Biology , vol. 22, n. 5, octombrie 2012, pp. 679–688, DOI : 10.1016 / j.sbi.2012.09.002 , ISSN 0959-440X ( WC ACNP ) , PMC 3737244 , PMID 23000031 .
  8. ^ (RO) Carl Zeiss Campus online MicroImaging | Anthozoa Fluorescent Proteins , pe zeiss-campus.magnet.fsu.edu . Adus la 15 noiembrie 2018 .
  9. ^ Fedor V. Subach și Vladislav V. Verkhusha,Chromophore Transformations in Red Fluorescent Proteins , în Chemical Reviews , vol. 112, nr. 7, 11 iulie 2012, pp. 4308-4327, DOI : 10.1021 / cr2001965 , ISSN 0009-2665 ( WC ACNP ) , PMC 3394910 , PMID 22559232 .
  10. ^ (EN) Fedor V Subach, George H Patterson, Juliana Manley, Jennifer M Gillette, Jennifer Lippincott-Schwartz și Vladislav V Verkhusha, mCherry fotoactivabil pentru microscopie cu fluorescență în două culori de înaltă rezoluție , în Nature Methods, vol. 6, nr. 2, 25 ianuarie 2009, pp. 153–159, DOI : 10.1038 / nmeth.1298 , ISSN 1548-7091 ( WC ACNP ) , PMC 2901231 , PMID 19169259 .
  11. ^ Michael J. Gebhardt, Rachael K. Jacobson și Howard A. Shuman,Văzând roșu; dezvoltarea pON.mCherry, o plasmidă de expresie constitutivă cu o gamă largă de gazde pentru bacterii Gram-negative , în PLoS ONE , vol. 12, nr. 3, 3 martie 2017, pp. e0173116, DOI : 10.1371 / journal.pone.0173116 , ISSN 1932-6203 ( WC ACNP ) , PMC 5336243 , PMID 28257493 .
  12. ^ Nina Akrap, Thorsten Seidel și B. George Barisas,distanțele Förster pentru transferul de energie rezonantă de fluorescență între mCherry și alte proteine ​​fluorescente vizibile , în Biochimia Analitică , vol. 402, n. 1, iulie 2010, pp. 105–106, DOI : 10.1016 / j.ab.2010.03.026 , ISSN 0003-2697 ( WC ACNP ) , PMC 2885848 , PMID 20347671 .
  13. ^ (EN) Ellen L. Lagendijk, Shamil Validov, Gerda EM Lamers, Sandra De Weert și Guido V. Bloemberg, Instrumente genetice pentru etichetarea bacteriilor Gram-negative cu mCherry pentru vizualizare in vitro și în habitate naturale, biofilm și studii de patogenitate , în FEMS Microbiology Letters , vol. 305, n. 1, 4 martie 2010, pp. 81–90, DOI : 10.1111 / j.1574-6968.2010.01916.x , ISSN 0378-1097 ( WC ACNP ) , PMID 20180857 .

Alte proiecte

Adus de la „ https://it.wikipedia.org/w/index.php?title=Mcherry&oldid=120517805 ”