RAPD

De la Wikipedia, enciclopedia liberă.
Salt la navigare Salt la căutare

RAPD ( R andom A mplification of P olymorphic D NA) este un tip de PCR în care segmentele de ADN amplificat sunt alese aleatoriu. Pentru a efectua un RAPD, sunt construiți un număr de primeri scurți (8-12 nucleotide) cu compoziție arbitrară și reacția de amplificare se efectuează folosind o întindere lungă de ADN genomic ca șablon. În cazul în care primerii sunt capabili să se asocieze cu ADN-ul, amplificarea va produce o serie de fragmente care, atunci când vor fi interpretate, vor permite aproximarea unui profil semi-individual al organismului analizat.

Nu este necesară nici o cunoaștere a secvenței ADN a genomului de interes, deoarece primerii se vor lega în orice punct al secvenței, deși nu este sigur care este situl de legare. Aceasta face din aceasta o metodă populară de comparare a ADN-ului organismelor care nu sunt studiate în mod special de comunitatea științifică.

Deoarece probabilitatea de asociere între primeri și șablon trebuie să fie maximizată, RAPD are unele limitări atunci când se utilizează o probă de ADN degradată. Mai mult, puterea sa de rezolvare este semnificativ mai mică decât cea a metodelor țintite de evaluare a ADN-ului care vizează secvențe specifice speciilor, cum ar fi analiza microsateliților .

În ultimii ani, RAPD a fost folosit pentru a caracteriza și urmări filogenia a numeroase specii de animale și plante.

Introducere

Markerii RAPD sunt fragmente decamerice (= 10 segmente lungi de nucleotide) de ADN care derivă din amplificarea PCR a segmentelor aleatorii de ADN genomic, care permit diferențierea unor indivizi genetic diferiți, deși nu sunt reproductibili: din acest motiv, multe reviste nu acceptă experimente ale căror rezultate se bazează exclusiv pe RAPD-uri.

Cum functioneazã

Spre deosebire de metodele tradiționale de PCR , RAPD nu necesită o cunoaștere specifică a secvenței ADN pentru a fi amplificată: primerul 10-mer în sine va putea amplifica sau nu un segment de ADN pe baza poziției în care se va asocia cu acesta. De exemplu, nu se vor produce fragmente dacă distanța dintre primerii după asocierea lor la secvență este prea mare sau dacă capetele 3 'ale primerilor nu sunt orientate una față de alta. Prin urmare, dacă s-a produs o mutație în fragmentul șablon la locul de legare al unuia dintre primeri, PCR nu va produce nimic, iar o rulare electroforetică va dezvălui o distribuție diferită a benzilor de marcare a fragmentelor amplificate mutate față de cele sălbatice .

Exemplu

RAPD este o metodă puternică și ieftină pentru tastarea a numeroase specii bacteriene. Imaginea prezentată la link-ul [1] este un gel de poliacrilamidă care prezintă trei profiluri RAPD generate de primerul OPE15 pentru „ Haemophilus ducreyi ” izolat din Tanzania, Senegal, Thailanda, Europa și America de Nord.

Selectarea unui primer cu secvența potrivită este de o importanță primordială, deoarece diferite secvențe vor produce modele diferite și vor asigura o precizie diferită în tastarea diferitelor tulpini.

Limitările RAPD

  • Aproape toți markerii RAPD sunt dominanți, adică nu este posibil să se distingă unde un segment de ADN este amplificat de un loc heterozigot (1 copie) sau homozigot (2 copii). Markerii codominanți RAPD, observați ca segmente de ADN de diferite dimensiuni, au o probabilitate redusă de a fi detectați.
  • PCR este o reacție enzimatică, prin urmare calitatea și concentrația ADN-ului șablon, concentrația componentelor PCR și condițiile de analiză pot influența puternic rezultatul. Aceasta implică faptul că tehnica RAPD este dependentă de laborator și trebuie acordată o atenție deosebită elaborării protocoalelor pentru a fi reproductibilă.
  • Nerespectarea grundului și a matriței poate duce la absența produsului, precum și la scăderea cantității produsului în sine. prin urmare, rezultatele RAPD pot fi dificil de interpretat.

Pași în dezvoltarea markerilor codominanți și specifici locului din RAPD:

  • Banda de marcare RAPD polimorfă este izolată din gel;
  • Este amplificat în PCR;
  • Produsul PCR este donat și secvențiat;
  • Primeri noi, mai lungi și specifici sunt proiectați pentru secvența ADN, care este denumită SCAR ( S echențiat C caracterizat cu un marker R egion mplificat).

Elemente conexe

linkuri externe

Biologie Portalul de biologie : Accesați intrările Wikipedia care se ocupă de biologie
Adus de la „ https://it.wikipedia.org/w/index.php?title=RAPD&oldid=104707487 ”