Hibridom

(1) Imunizarea șoarecilor
(2) Îndepărtarea celulelor B din splină
(3) Cultura celulară a mielomului
(4) Fuziunea mielomului și a celulelor B.
(5) Separarea liniilor celulare
(6) Proiectarea liniilor adecvate
(7 ) Proliferarea in vitro (a) sau in vivo (b)
(8) Colecție

Un hibridom este o celulă proiectată pentru producerea masivă de anticorpi monoclonali , adică anticorpi monospecifici, deoarece aceștia sunt produși de un singur tip de celulă mamă. Prin urmare, ele sunt identice una cu cealaltă. Pentru a produce hibridomi, celulele B (un tip de leucocit) sunt îndepărtate din splina animalului imunizat (șobolan sau iepure) și apoi fuzionate cu mieloame (linii tumorale ale celulelor B), pentru imortalizarea lor.

Procedura de hibridizare începe cu injectarea unui antigen într-un șoarece (sau alt mamifer), provocând un răspuns imun. Un tip de leucocit, celulele B produc anticorpi care se leagă de antigenul injectat. Acești anticorpi nou produși sunt apoi obținuți de la șoarece. Aceste celule B izolate sunt fuzionate la rândul lor cu o linie celulară B de tip mielom imortalizat pentru a produce o linie celulară hibridă numită hibridom , care posedă atât capacitatea de a produce anticorpi împotriva celulelor B, cât și longevitatea și reproductivitatea exasperate tipice mielomului. Hibridomii pot crește în cultură, fiecare cultură începând cu o celulă viabilă de hibridom, producând culturi fiecare dintre acestea constând din hibridomi identici genetic care pot produce un anticorp pe cultură (monoclonal), mai degrabă decât complexe de anticorpi diferiți (policlonali). Linia celulară de mielom utilizată în această procedură este selectată pentru capacitatea sa de a crește în culturi de țesut și absența sintezei de anticorpi. Spre deosebire de anticorpii policlonali , care sunt amestecuri de diferite molecule de anticorpi, anticorpii monoclonali produși de fiecare linie de hibridom sunt identici din punct de vedere chimic.

Prima idee de a produce anticorpi monoclonali s-a născut în 1975, când César Milstein a creat o procedură experimentală împreună cu Georges JF Köhler . În 1984, cei doi au împărțit Premiul Nobel pentru medicină și fiziologie cu Niels Kaj Jerne , care a adus contribuții majore la imunologie. Termenul hibridoma a fost inventat de Leonard Herzenberg în anul sabatic în laboratorul lui César Milstein între 1976 și 1977. ^[1]

Metodă

Celulele hibridomului cresc într-o cultură histologică. Imaginea prezintă o singură clonă de celule producând fiecare o cantitate mare de anticorpi monoclonali specifici secretați de celule și care pot fi ușor purificați din mediul de cultură.

Cobaiii de mamifere , de exemplu șoarecele, sunt primii care au fost expuși la antigenul împotriva căruia a fost generat anticorpul. De obicei, acest lucru se face printr-o serie de injecții cu antigenul în cauză, pe parcursul a câteva săptămâni. Aceste injecții sunt de obicei urmate de utilizarea electroporării in vivo, care crește semnificativ răspunsul imun. Odată ce splenocitul este izolat din splina mamiferelor, celulele B sunt fuzionate cu celulele de mielom imortalizate. Fuziunea celulelor B cu celulele mielomului se poate face prin electrofuziune. Electrofuzia determină celulele B și celulele mielomului să se alinieze și să fuzioneze cu aplicarea unui câmp electric. Alternativ, fuziunea dintre limfocitele B și celulele mielomului se realizează prin intervenția promotorilor chimici de fuziune a membranei, cum ar fi polietilen glicol .

Celulele mielomului sunt pre-examinate pentru a se asigura că nu secretă ele însele anticorpi și că le lipsește gena HGPRT hipoxantină-guanină fosforibosiltransferază (HGPRT), făcându-le sensibile la mediul HAT (de jos).

Celulele condensate sunt incubate în mediu hipoxantină - aminopterină - timidină (HAT) timp de aproximativ 10-14 zile. Aminopterina blochează calea care permite sinteza nucleotidelor. Prin urmare, celulele de mielom nefuzate mor, deoarece nu pot produce nucleotide de novo sau căi de salvare din cauza absenței HGPRT. Îndepărtarea acestora din urmă este necesară deoarece riscă să depășească alte celule, în special pe cele slabe. Celulele B care nu s-au contopit mor pentru ciclul lor scurt de viață. În acest fel, numai celulele B hibridizate cu cele mielomice supraviețuiesc, deoarece gena HGPRT a celulelor B este funcțională. Aceste celule produc anticorpi (proprietăți ale celulelor B) și sunt nemuritoare (proprietăți ale celulelor mielomului). Mediul de incubație este apoi diluat în plăci cu mai multe godeuri, astfel încât fiecare godeu să conțină o singură celulă. Deoarece anticorpii dintr-un puț provin din aceeași celulă B, aceștia vor fi direcționați către aceeași epitonă și, prin urmare, sunt anticorpi monoclonali.

Următorul pas este un proces rapid de screening, care identifică și selectează numai acele hibridomi care produc anticorpi cu specificitate adecvată. Prima tehnică de screening utilizată se numește ELISA . Cultura hibridomului supernatant, enzima secundară conjugată și un substrat colorat sunt incubate împreună. Formarea unui produs colorat indică un hibridom pozitiv. Alternativ, poate fi utilizat screening imunocitochimic. ^[2]

Celula B care produce anticorpii doriti poate fi clonata pentru a produce multe clone identice. Mediile suplimentare care conțin o interleukină-6, cum ar fi briclonul, sunt esențiale pentru această etapă. Odată ce colonia hibridomului s-a stabilizat, va crește continuu în mediul de cultură sub forma RPMI 1640 (cu antibiotice și ser) și va produce anticorpi. ^[2]

Plăcile cu mai multe godeuri sunt utilizate inițial pentru cultivarea hibridomelor. În urma selecției, cultura va fi transferată în baloane. Acest lucru ajută la menținerea sănătății hibridomilor și asigură existența unor celule suficiente pentru crioconservare și supernatant pentru teste ulterioare. Supernatantul are un randament cuprins între 1 și 60 µg / ml de anticorp monoclonal, care este stocat la -20 ° C sau mai puțin atât timp cât este necesar ^[2]

Folosind supernatantul de cultură sau un preparat de imunoglobulină purificat, se pot efectua analize suplimentare ale unui potențial anticorp monoclonal hibridizat, în termeni de reactivitate, specificitate și reactivitate încrucișată. ^[2]