Tehnici de imagistică in vivo
Se crede că acest articol sau secțiune despre subiectul biologiei este verificat . |
Această intrare sau secțiune despre biologie nu citează sursele necesare sau cei prezenți sunt insuficienți . |
Tehnici pentru imagistica in vivo a celulei plantei.
Tehnicile de imagistică in vivo permit aprofundarea studiului interacțiunilor particulare dintre proteine, funcția și localizarea acestora; ele permit, de asemenea, vizualizarea diferitelor compartimente celulare și determinarea dimensiunii, formei, mobilității și eventualelor fenomene de dinamism și răspuns de mediu.
Acest tip de tehnici sunt împărțite în principal în două categorii: cele care utilizează proteine cu fluorescență intrinsecă, cum ar fi GFP și RdFP, sau care exploatează fenomenele de bioluminiscență, cum ar fi luciferina sau aequorina, și cele care utilizează sonde fluorescente. Prin sondă fluorescentă înțelegem un colorant fluorescent sau o sondă moleculară, denumită în general fluorofori, utilizată pentru a evidenția regiuni specifice sau pentru a răspunde la un anumit stimul.
Bioluminiscența este un fenomen de producție de lumină operat de fotoproteine prezente în unele organisme. Utilizarea acestor proteine nu necesită iluminare, iar intensitatea luminii emise este în general redusă. Cele mai cunoscute proteine bioluminescente sunt Luciferaza și Equorin.
Luciferaza catalizează oxidarea Luciferinei : rezultatul este emisia de lumină cu formarea oxiluciferinei.
Aequorin , pe de altă parte, este o fotoproteină compusă din două unități distincte, apoproteina, cu o greutate moleculară de aproximativ 22 kDa, și grupa protetică celenterazină, o moleculă aparținând familiei luciferinelor. În prezența oxigenului molecular, cele două componente interacționează spontan, formând proteina funcțională. De obicei, Equorine este utilizat pentru studiul rolului ionului Ca2 + și pentru monitorizarea spațială și specifică în timp a modificărilor concentrațiilor sale care apar în celulă. Equorina poate fi clonată în construcții recombinante care permit măsurarea variațiilor de Ca2 + în diferitele districte celulare (RE, mt, citoplasmă, nucleu ...). Schimbarea conformațională a apoproteinei indusă de ionul Ca2 + duce la peroxidarea coenzimei, care determină emisia de lumină albastră.
Proteina GFP este utilizată pentru studii de diferite tipuri: este utilizată atât în construcții care exploatează proprietatea sa de autofluorescență, cât și ca una dintre componentele sondelor moleculare. Tehnicile care utilizează GFP permit analiza fenomenelor de organizare intracelulară și dinamism ale organelor și proteinelor.
Fuziunea GFP cu proteinele cu funcție cunoscută sau necunoscută a făcut posibilă detectarea localizării lor și a oricăror deplasări de la un compartiment la altul. Pentru a efectua acest tip de analiză, secvența de codificare GFP este fuzionată cu secvența 5 'sau 3' a genei de interes. Acest lucru permite producerea unei plante transgenice stabile capabile să sintetizeze o proteină himerică exprimată numai în anumite districte. Formarea unei proteine himerice de acest tip face posibilă determinarea oricăror deplasări în urma stimulilor de mediu sau a evenimentelor de dezvoltare. Utilizarea GFP și a variantelor sale cu proprietăți spectrale diferite au fost de asemenea folosite pentru a vizualiza structurile intracelulare și pentru a determina caracteristicile acestora. Vizualizarea unor structuri, cum ar fi nucleul și peretele celular, se poate face printr-o analiză microscopică simplă a GFP. Identificarea altor organite sau structuri poate necesita totuși o analiză mai precisă: o metodă utilizată este de a suprapune imaginea obținută prin analiza fluorescenței proteinelor specifice unui anumit compartiment cu cea derivată din utilizarea GFP. De exemplu, co-localizarea semnalului GFP cu semnalul roșu al autofluorescenței clorofilei poate permite vizualizarea cloroplastului.
Există mai multe tehnici de imagistică in vivo care utilizează GFP și variantele sale: printre acestea se numără FRET, FRAP și FLIP.
Mecanismul FRET , sau transferul de energie prin rezonanță de fluorescență, exploatează prezența a două molecule fluorescente, numite donator și acceptor. Donatorul poate fi excitat la o anumită lungime de undă. Această moleculă emite energie care, la rândul ei, poate fi transmisă acceptorului, capabilă să emită o fluorescență care poate fi văzută de operator. Acest proces are loc într-un mod optim numai dacă cele două molecule sunt la o distanță rezonabilă de aproape (<100 Ǻ). Cu toate acestea, există unele limitări în utilizarea acestei tehnici: pe de o parte, de fapt, spectrul de emisie al donatorului și spectrul de absorbție al acceptorului trebuie să aibă o suprapunere mare (altfel transferul de energie ar fi zero); pe de altă parte, cele două spectre de emisie nu trebuie suprapuse, altfel detectarea emisiei acceptorului ar prezenta un zgomot ridicat de fond legat de emisia simultană a celor două proteine. FRET poate fi utilizat pentru o serie de studii celulare. De fapt, permite analiza interacțiunilor dintre două proteine, monitorizarea modificărilor conformaționale din cadrul unei molecule sau studierea activității proteazelor: în timp ce în primele două cazuri asistăm la dispariția emisiilor donatorului și la apariția emisiei acceptorului, în al treilea caz reacția de proteoliză are efectul opus din cauza pierderii interacțiunii dintre donator și acceptor. În plus, FRET intramolecular este, de asemenea, utilizat pentru a testa modificările concentrației ionului Ca2 +, de exemplu în celulele de gardă ale A. thaliana (Galben-cameleon-2). Construcția utilizată pentru a testa concentrația de Ca2 + este compusă din CFP și YFP utilizate ca donator și respectiv acceptor, calmodulină utilizată pentru a lega Ca2 + șiproteina de legare a calmodulinei M13. Când Ca2 + se leagă de calmodulină, o modificare a conformației este indusă de M13, ceea ce duce la abordarea CFP și YFP permițând astfel schimbarea semnalului emis.
FRAP-urile și FLIP-urile exploatează faptul că moleculele fluorescente sunt inactivate atunci când sunt iradiate. Cu aceste tehnici este posibil să se examineze dacă două organite sunt în legătură una cu cealaltă.
FRAP , sau recuperarea fluorescenței după albire foto, se bazează pe principiul respectării ratei de recuperare a fluorescenței datorită mișcării unui indicator fluorescent într-o zonă a membranei care conține același indicator care anterior a fost făcut non-fluorescent de înseamnă un puls intens.un laser. Dacă cele două compartimente sunt conectate, va exista o recuperare a fluorescenței, dacă în schimb sunt izolate nu va exista un astfel de eveniment. Această tehnică a fost utilizată pentru a demonstra traficul de vezicule între RE și Golgi.
FLIP este o tehnică derivată din FRAP care constă în utilizarea prelungită a laserului într-o anumită regiune. Toate regiunile celulei care sunt conectate la zona în care molecula fluorescentă este inactivată își vor pierde treptat fluorescența datorită mobilității proteinei inactivate în sine. FLIP a fost utilizat pentru a demonstra conexiunea cloroplastelor prin intermediul strobiliilor (albirea strobiliilor există o albire treptată a cloroplastelor).