PBluescript

Această intrare despre subiectul biologie este orfană , ceea ce înseamnă că nu există legături de intrare din alte intrări . Vă rugăm să introduceți cel puțin un relevant și nu generice și elimina avertismentul. Urmați sfaturile de proiectare de referință .

Această intrare sau secțiune despre genetică nu citează sursele necesare sau cei prezenți sunt insuficienți . Puteți îmbunătăți această intrare adăugând citate din surse de încredere în conformitate cu liniile directoare privind utilizarea surselor . Urmați sfaturile de proiectare de referință .

Această intrare sau secțiune pe tema geneticii nu este încă formatată conform standardelor . Contribuiți la îmbunătățirea acestuia în conformitate cu convențiile Wikipedia . Urmați sfaturile de proiectare de referință .

În genetică, pBluescript (pBS) sau pBluescript II este o fagemidă disponibilă comercial (o plasmidă cu origine fagică ) care conține mai multe secvențe utile pentru utilizarea în clonarea cu bacteriofagi . Secvențele includ un polilinker (MCS), unul pentru rezistența la antibiotice la ampicilină și o origine de replicare a Escherichia coli și un fag de ajutor . Secvența polilinkerului este conținută într-o genă controlată de LacZ concepută pentru a da o culoare albastră atunci când este exprimată în bacterii. Acest lucru se realizează de obicei prin X-gal găsit în mediile de cultură de agaroză utilizate pentru cultivarea bacteriilor cu pBS. Dacă gena este întreruptă prin inserarea cu succes a unei secvențe de ADN , bacteria prezintă o colorare albă în screeningul albastru-alb , distingând recombinările reușite de acele fagemide nealterate. Aceste plasmide recombinate pot fi apoi utilizate pentru o varietate de tehnici moleculare. Unele dintre aplicațiile pentru care se pot utiliza recombinanți pBS sunt determinarea expresiilor și crearea de biblioteci genomice.

Fagemidele PBluescript II sunt vectori de clonare utilizați pentru a simplifica cele mai frecvente proceduri de secvențiere și clonare, inclusiv construcția de deleții grefate pentru secvențierea ADN, generarea de transcripții ARN in vitro și mutageneză specifică site-ului și cartografierea genelor. PBluescript II are un polilinker inextensiv cu 21 de situri de recunoaștere unice pentru enzimele de restricție, inclusiv promotori pentru ARN polimeraze T7 și T3 care pot fi utilizate pentru a sintetiza ARN in vitro. Alegerea promotorului utilizat pentru inițierea transcripției determină ce parte a inserției clonate din polilinker va fi transcrisă. Polilinkerii și promotorii ARN polimerazelor T7 și T3 sunt prezenți în porțiunea N-terminală a fragmentului genei lacZ. Un total de 131 de aminoacizi din secvența de codificare pentru β-galactozidază sunt prezenți în fagemidă, dar secvența de codare este întreruptă de polilinkerul mare (există 36 de aminoacizi din secvența de inițiere Met până la site-ul Eco RI). Fagemidele fără inserții în polilinker vor produce colonii albastre în tulpinile corespunzătoare de bacterii (de exemplu, tulpini care conțin lacZΔM15 pe un episom F, cum ar fi, printre altele, XL1-Blue MRF´). Fagemidele cu inserții vor produce colonii albe, deoarece inserția perturbă secvența de codificare a genei lacZ.

pBluescript II (+) și (-) sunt disponibile cu două orientări polilinker indicate ca KS sau SK în conformitate cu această convenție:

(1) în orientarea KS, situl de restricție Kpn I este cel mai apropiat de promotorul lacZ în timp ce cel Sac este cel mai îndepărtat;

(2) în orientarea SK, site-ul Sac I este cel mai aproape de promotorul lacZ, în timp ce Kpn I este cel mai îndepărtat.

La marginea promotorilor T3 și T7 se află site-uri BssH II. Această rară secvență de scindare cu șase baze permite inserarea plus promotorii ARN ai fagului T să fie excizați și utilizați pentru cartografierea genelor. Fagemidele pot fi recuperate sub formă de fire simple (ss) de ADN. Fagemidele conțin o regiune filamentoasă intergenică (legată de M13) a fagului f1 la 454-bp, care include originea replicării a 307-bp. Orientările (+) și (-) ale regiunii intergenice f1 permit recuperarea ssDNA antisens a senzorului cu un fag helper. Acest ssDNA poate fi utilizat pentru secvențierea dideoxinucleotidelor (metoda Sanger) sau pentru mutageneză specifică site-ului.