Reporter genetic
O genă reporter este o genă a cărei activitate este ușor de monitorizat prin histochimie sau prin metode imunologice; codifică un produs genetic care poate fi utilizat pentru a studia activitatea secvențelor reglatoare ale altei gene de interes.
Expresia acestor gene este ușor identificabilă și cuantificabilă prin analize simple, din acest motiv sunt utilizate ca markeri selectabili.
Genele reporter sunt adesea utilizate ca indicatori pentru a evalua succesul transfecției sau evidențiază dacă o anumită genă a fost dobândită de celulele luate în considerare și dacă gena menționată anterior este corect exprimată. Prin urmare, este important ca gena reporter utilizată să nu fie exprimată în mod natural în celulele de interes.
Pe lângă eficiența transfecției, genele reporter pot fi folosite și pentru a studia:
- puterea unui promotor
- soarta intracelulară a unui produs genetic
- interacțiunea dintre două proteine
- interacțiunea dintre proteine și acizi nucleici
Tipuri de gene reporter
Cele mai utilizate gene reporter sunt:
CAT ( cloramfenicol acetiltransferaza )
El a fost primul reporter folosit. În prezența CAT și a unui donator de acetil (C14 marcat CoA ), cloramfenicolul este acetilat de enzimă producând un amestec de molecule marcate care pot fi detectate pe TLC ( cromatografie în strat subțire ) sau prin autoradiografie . Ulterior, pentru a evita utilizarea substanțelor radioactive, a fost utilizată gena lacz a E. coli, care codifică β-galactozidaza și apoi luciferaza.
Gen LacZ ( β-galactozidază )
Gena LacZ codifică β-galactozidaza care este o enzimă hidrolitică care catalizează în polizaharide cunoscute sub numele de beta-galactozide prin ruperea legăturilor beta-glicozidice. Această enzimă determină colorarea celulelor care o exprimă atunci când se găsesc într-un mediu care conține X-Gal (X-galactoză) care hidrolizat generează un produs albastru (numit tehnică de screening alb-albastru).
Deoarece CAT și β-galactozidaza sunt enzime stabile a căror activitate persistă mult timp în celulele care le exprimă, acești reporteri nu ar putea fi utilizați dacă se vor observa schimbări rapide în expresia genelor. Din acest motiv, s-a folosit utilizarea luciferazei.
Luciferase
Luciferaza este o enzimă care catalizează oxidarea luciferinei o reacție care, în prezența unui exces de ioni de ATP , oxigen și magneziu, pierde energie (electroni) sub formă de radiație luminoasă care poate fi detectată cu un luminometru. Această reacție are o sensibilitate foarte mare și are o descompunere rapidă.
GFP ( Proteină fluorescentă verde )
GFP derivă din meduza Aequorea victoria . Având în vedere capacitatea sa de a emite lumină după expunerea la UV , este utilizată ca marker pentru a localiza locația anumitor proteine sau pentru a studia expresia genelor în celule. Structura sa este organizată în 11 β-foi cu un aranjament în butoi care înconjoară fluoroforul.