Transfecție
Această intrare sau secțiune despre biotehnologie nu menționează sursele necesare sau cei prezenți sunt insuficienți . |
Transfecția este procesul de introducere a materialului biologic exogen în celulele eucariote , în majoritatea cazurilor de mamifere . Inserarea materialului genetic, de obicei incluzând ADN și ARNsi , este mai frecventă, dar, în general, proteinele (cum ar fi anticorpii ) pot fi, de asemenea, transfectate. Procesul și metodele de implementare sunt similare cu cele pentru transformarea bacteriană , care totuși privește bacteriile și, uneori, celulele vegetale.
Procesul de transfecție se poate face:
- in vitro - pe celule țintă în culturi celulare pe termen lung;
- ex vivo - pe celule izolate dintr-un organism și transferate în mediu de cultură;
- in vivo - direct pe celulele unui organism.
Aplicații
Transfecția este utilă în toate studiile de genetică și biologie moleculară care doresc să obțină informații despre activitatea și funcția anumitor gene . Acest lucru se poate face, în general, în două moduri: prin supraexprimarea genei în cauză sau prin mutarea acesteia.
În primul caz, o producție mai mare decât cea normală a produsului genetic este, prin urmare, indusă prin inserarea de copii suplimentare ale aceleiași gene, de exemplu. În al doilea caz, gena va fi „blocată”. Există două metode de tăcere a unei gene. Prin formarea unor sisteme knock-out , care schimbă gena din celulă cu una, cea exogenă, inactivă; tehnica se bazează pe recombinarea regiunilor care înconjoară gena de interes. Prin inserarea siARN ( interferență ARN ).
În toate cazurile, culturile transfectate vor fi urmărite și orice consecințe analizate.
Transfecție tranzitorie și stabilă
În funcție de soarta vectorului inserat, se poate face o distincție între transfecția tranzitorie și transfecția stabilă . Transfecția este tranzitorie atunci când vectorul rămâne în celulă ca un fragment extracromozomal, adică nu se integrează în genomul celular; în acest caz proprietățile induse de transfecție rămân pentru o perioadă scurtă de timp, de obicei dispărând înainte de 72 de ore. Transfecția este stabilă, totuși, atunci când ADN-ul exogen este integrat stabil în genom: efectul rămâne, așadar, pentru întreaga viață a celulei și va fi transmis și celulelor rezultate.
Transfecția tranzitorie este cu siguranță mai rapidă, mai ușoară și mai ieftină, dar evident permite studii de timp limitat. Transfecția stabilă este considerată necesară ori de câte ori efectul genetic este pe termen mediu-lung: de exemplu atunci când se studiază gene despre care se crede că sunt conectate la procesele de diferențiere celulară .
Selectarea celulelor transfectate
Indiferent de tipul de transfecție și de metoda utilizată, este necesar să se dezvolte tehnici care fac posibilă, în cultura celulară, izolarea numai a acelor celule în care a avut loc efectiv procesul de transfecție. Această funcție este îndeplinită prin acțiunea unor secvențe conținute în vector împreună cu gena de interes. Există două tehnici principale:
- vector cu markeri de selecție - o genă pentru rezistența la un anumit antibiotic este inserată în vectori cu tehnici de inginerie genetică , precedată de un promotor puternic care stimulează transcrierea acestuia. Același antibiotic este introdus în mediul de cultură: dacă vectorul a intrat efectiv, acesta va da celulelor rezistență; în schimb, toate celulele netransfectate vor fi ucise.
- vectori cu GFP - în vectori nu există markeri, ci o secvență care codifică Proteina Fluorescentă Verde (GFP), o proteină care emite radiații pe lungimea de undă a verdeului, oferind fluorescență în condiții adecvate. Doar celulele care vor fi vizibile la acea lungime de undă vor fi supuse transfecției.
Metode de transfecție
Având în vedere cazul mai general, introducerea ADN-ului, problema care apare se referă la faptul că atât acidul nucleic cât și membrana celulară sunt încărcate negativ: ADN-ul, datorită forțelor de repulsie electrostatică , nu va interacționa niciodată spontan cu membrana. Multe metode de transfecție servesc de fapt pentru a masca grupurile anionice ale ADN-ului.
Metode chimice
Una dintre metodele mai simple și mai puțin costisitoare este cea care folosește fosfat de calciu, dezvoltată pentru prima dată de S. Bacchetti și FL Graham în 1977 [1] . Procedura implică amestecarea unei soluții tampon HEPES conținând ioni fosfat împreună cu o soluție de clorură de calciu (CaCl2) și ADN-ul care trebuie transfectat. Amestecarea celor două soluții produce un precipitat de fosfat de calciu, care va lega molecula de ADN. Precipitatul este retras, resuspendat și adăugat la mediul de cultură (de obicei o cultură monostrat). Printr-un proces care nu este încă bine cunoscut, celulele leagă precipitatul și permit ADN-ului să intre. Precipitațiile pot apărea și cu dietil-amino-etil-dextran.
O altă metodă biologică foarte eficientă folosește lipozomi , vezicule lipidice mici care încorporează ADN și sunt induse să intre în celulă odată cu acesta, simulând procesele de endocitoză celulară. O altă metodă implică utilizarea dendrimerilor , molecule foarte ramificate care se leagă de ADN și îl transportă în celulă.
Metode fizice
Cea mai utilizată metodă este electroporarea , care constă în aplicarea unei diferențe de potențial pe laturile cuvei care conține soluția cu celulele și ADN-ul care trebuie inserat: șocul electric determină formarea de pori în membrană care permit intrarea material genetic. Defectul este procentul ridicat (%) de celule care nu supraviețuiesc după tratament.
O altă metodă este microinjecția : introducerea materialului printr-un ac subțire direct în celulă. Din motive practice evidente, este utilizat mai frecvent în clinică, în tehnici precum fertilizarea artificială , decât în laboratorul în care lucrați cu un număr mare de celule.
O abordare directă a transfecției este atunci așa-numita metodă de tun genic în care ADN-ul este cuplat la un solid inert (de obicei aur ) care este „tras” direct în celulă.
Metode care utilizează viruși
ADN-ul poate fi în cele din urmă inserat prin transducție , apoi transportat de un virus . În principal utilizate sunt adenovirusurile , retrovirusurile și lentivirusurile .
Notă
Elemente conexe
Alte proiecte
-
Wikționarul conține dicționarul lema « transfecție »
linkuri externe
- ( EN ) Transfection / Transfection (altă versiune) , în Encyclopedia Britannica , Encyclopædia Britannica, Inc.
