Proteină fluorescentă verde

De la Wikipedia, enciclopedia liberă.
Salt la navigare Salt la căutare
Proteine ​​fluorescente verzi
PDB 1ema EBI.jpg
Structura proteinei fluorescente verzi
Proteină
UniProt P42212
PDB 1GFL
Editați datele pe Wikidata · Manual
Identificatori
Simbol Reginal
Pfam PF01353
Clanul Pfam CL0069
InterPro IPR011584
SCOP 1ema

Proteina fluorescentă verde ( GFP , în proteina fluorescentă verde italiană) este o proteină exprimată în meduza Aequorea victoria . Datorită proprietăților sale de fluorescență , dimensiunilor sale modeste și posibilității de a modifica caracteristicile sale spectroscopice în anumite limite, GFP a devenit un instrument larg răspândit pentru experimentele și tehnicile de biologie moleculară în ultimele decenii. GFP, dacă este lovit și excitat de o radiație la o anumită lungime de undă , este capabil să retransmită lumină verde strălucitoare. Cu toate acestea, există acum multe forme modificate de GFP, capabile să absoarbă și să emită radiații diferite de cele ale proteinei originale.

Structura

Diagrama de bandă GFP preluată din baza de date PDB .
GIF care arată întreaga structură GFP și mărirea cromoforului fluorescent. Filmat de Erik A. Rodriguez cu UCSF Chimera de la PDB: 1EMA .

GFP este alcătuit din 238 de aminoacizi și are o greutate moleculară de 27.000 de daltoni . Este format din 11 foi beta dispuse în cerc pentru a forma o structură numită β-butoi ( β-butoi sau β-cutie ). Există, de asemenea, două segmente de helix alfa , unul la baza butoiului, celălalt de-a lungul axei sale centrale. Această ultimă helix conține fluoroforul (adică porțiunea capabilă să emită fluorescență), format pornind de la tripeptida Ser 65- Tyr 66- Gly 67. Structura, în ansamblu, este foarte compactă, astfel încât să protejeze fluoroforul de reacțiile cu alte molecule care l-ar putea inactiva.

Maturarea proteinelor și fluoroforilor

Proteina durează aproximativ zece minute pentru a se întoarce în structura sa terțiară corectă. Trei reacții succesive sunt apoi necesare pentru formarea fluoroforului funcțional: ciclizarea, deshidratarea (ambele în total în aproximativ 3 minute) și oxidarea (de la 19 la 83 de minute). În urma acestor evenimente, se formează un inel heterociclic cu cinci atomi (inelul imidazolinonei ) și se formează alte două duble legături datorită deshidratării și oxidării. Fluoroforul, atunci când este excitat, este astfel capabil să emită lumina verde caracteristică.

Fluorescenţă

La fel ca orice substanță fluorescentă , GFP trebuie întâi lovită de o radiație, cu o lungime de undă și, prin urmare, energie, care permite unora dintre electronii săi să treacă în starea excitată (faza de absorbție ); după un scurt moment de timp, electronii revin la starea de bază (starea inițială) și re-emit o altă radiație, dar cu mai puțină energie decât cea inițială (faza de emisie ). În cazul GFP, absorbția are vârfuri cu radiații la lungimi de undă de 395 nm și 475 nm. Emisia va avea un maxim maxim în jur de 505 nm. Aceasta înseamnă că atât radiația ultravioletă (395 nm), cât și radiația din spectrul vizibil (475 nm), în special culoarea albastră, pot fi utilizate pentru a excita proteina. În ambele cazuri, GFP va emite o radiație de culoare verde (505 nm). Sunt utilizate în general pentru absorbția radiațiilor albastre, pentru a evita riscurile asociate cu utilizarea razelor UV.

Clasificare

Desen obținut pe o placă de cultură, prin strângerea culturilor bacteriene care conțin diferite forme de GFP (plus o altă proteină cu fluorescență roșie).

GFP exprimat în Aequorea victoria se mai numește GFP de tip sălbatic și face parte din prima clasă a acestor proteine. Există șapte clase în total, distinse pe baza tipului de mutație (sau mutații) în comparație cu tipul sălbatic și a caracteristicilor de absorbție și emisie diferite. GFP clasa II și III, de exemplu, sunt foarte asemănătoare cu GFP clasa I, dar au doar unul dintre cele două vârfuri de absorbție prezente în ea. Clasa IV include așa-numita YFP ( proteină fluorescentă galbenă ), care fluorescă în galben în loc de verde. Clasei V și VI aparțin CFP ( proteină fluorescentă cian ), care emit cu o culoare albastru-gri și BFP ( proteină fluorescentă albastră ), care emit în albastru. Diferitele forme de GFP sunt obținute prin mutageneză aleatorie sau mutageneză direcționată la locul de bază a genei sale. Mutațiile sunt, de asemenea, introduse pentru a modifica caracteristici precum intensitatea emisiilor, viteza de pliere , sensibilitatea la pH .

Aplicații

Luminiscența GFP este un fenomen intrinsec al proteinei în sine și nu necesită substraturi sau enzime , astfel încât aceasta este utilizată pe scară largă ca marker în identificarea și investigațiile de localizare subcelulară a proteinelor. În aceste teste, secvența nucleotidică a proteinei X care trebuie identificată este fuzionată cu secvența nucleotidică a GFP într-un vector de expresie care este de obicei o plasmidă . Plasmida recombinantă este inserată în celula eucariotă, de obicei prin electroporare , astfel încât, odată ce se află în interiorul celulei, plasmida se integrează în genom prin recombinare specifică site-ului în cadrul genei pentru proteina mitocondrială. Acest proces duce la inactivarea genei sălbatice pentru X și la exprimarea genei recombinante pentru X-GFP. Identificarea și localizarea subcelulară a X-GFP pot fi apoi vizualizate prin intermediul microscopiei cu fluorescență care dezvăluie semnalele produse de GFP și, prin urmare, identifică și X. Această tehnică este foarte puternică, deoarece localizarea proteinei studiate este dezvăluită in vivo și este, de asemenea, posibil să o urmăriți în timp.

Vertico SMI utilizează GFP și combină în cele din urmă microscopia cu modularea spațială a iluminării, ajungând la rezoluții sub 10 nanometri (1 nanometru = 1 nm = 1 × 10 −9 m) [1] [2] [3] .

  • Super

  • Localizarea moleculelor YFP într-o celulă (distanță 15 nm) Tehnologia SPDMphodod

  • Colocalizarea moleculelor GFP și RFP (120.000 molecule) tehnologia 2CLM

GFP în art

Sculptura din oțel Medusa (Jellyfish Steel) (2006) de Julian Voss-Andreae bazată pe GFP. Imaginea prezintă sculptura din oțel inoxidabil la laboratoarele Friday Harbor de pe insula San Juan (Washington, Statele Unite), unde a fost descoperit GFP.

Julian Voss-Andreae , un artist născut în Germania și specializat în „sculpturi proteice”, [4] a creat sculpturi bazate pe structura GFP, inclusiv „Green Fluorescent Protein” (2004) 1,70 m înălțime [5] și „Steel Medusa” "(2006) 1,40 m înălțime. Această din urmă sculptură este situată în locul descoperirii GFP, realizată de Shimomura în 1962, și anume Laboratoarele Friday Harbor ale Universității din Washington [6] .

Notă

  1. ^ David Baddeley, Claudia Batram și Yanina Weiland, Analiza nanostructurii utilizând microscopie de iluminare modulată spațial , în Nature Protocols , vol. 2, nr. 10, 2007, pp. 2640-2646, DOI : 10.1038 / nprot.2007.399 . Adus la 13 aprilie 2018 .
  2. ^ Jürgen Reymann, David Baddeley și Manuel Gunkel, Analiza structurală de înaltă precizie a complexelor subnucleare în celule fixe și vii prin microscopie cu iluminare modulată spațial (SMI) , în Chromosome Research: An International Journal on the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology , vol. 16, n. 3, 2008, pp. 367–382, DOI : 10.1007 / s10577-008-1238-2 . Adus la 13 aprilie 2018 .
  3. ^ (EN) P. Lemmer, M. Gunkel și D. Baddeley, SPDM: microscopie cu lumină cu rezoluție cu o singură moleculă la nanoscală , în Physics Applied B, vol. 93, nr. 1, 1 octombrie 2008, p. 1, DOI : 10.1007 / s00340-008-3152-x . Adus la 13 aprilie 2018 .
  4. ^ (EN) Julian Voss-Andreae, Protein Sculptures: Life's Building Blocks Inspire Art , în Leonardo, vol. 38, nr. 1, 13 martie 2006, pp. 41–45, DOI : 10.1162 / leon . 2005.38.1.41 . Adus la 13 aprilie 2018 .
  5. ^ Alexander Pawlak, Inspirierende Proteine , în Physik Journal , vol. 4, 2005, p. 12.
  6. ^ Sculptura Julian Voss-Andreae , pe julianvossandreae.com . Adus 14/06/2007 .

Bibliografie

Elemente conexe

Alte proiecte

linkuri externe

Biologie Portalul de biologie : accesați intrările Wikipedia care se ocupă de biologie
Adus din „ https://it.wikipedia.org/w/index.php?title=Green_fluorescent_protein&oldid=121697780 ”