Mutageneză specifică site-ului
Mutageneza specifică site-ului este o tehnică de biologie moleculară în care o mutație este creată selectiv la un anumit loc al unei molecule de ADN , de obicei o plasmidă .
Tehnică
Prin urmare, tehnica diferă de mutageneza normală , în care mutațiile sunt induse, dar sunt distribuite aleator în secvențele ADN. În general, mutageneza situs direcționată necesită cunoașterea secvenței de tip sălbatic ( de tip sălbatic) a genei prin mutageneză. Mutația inserată poate fi o substituție de bază sau o inserție sau ștergere de nucleotide în raport cu secvența originală. Tehnica este, de asemenea, numită uneori mutageneză directă a situsului sau mutageneză directă a oligonucleotidelor .
Invenţie
Mutageneza specifică site-ului a fost dezvoltată pentru prima dată în 1978 folosind oligonucleotide pentru sinteza in vitro a ADN-ului mutant. Tehnica a dobândit un rol atât de important în biologia moleculară și biochimie, încât Michael Smith , creatorul acesteia, a împărțit Premiul Nobel pentru chimie în octombrie 1993 cu Kary Mullis , inventatorul PCR .
Mutageneza PCR
Principala tehnică de mutageneză direcționată la locul utilizează implantarea experimentală a PCR . De fapt, sunt produse oligonucleotide, care acționează ca primeri , conținând mutația dorită. Primerii, ca și în PCR, sunt hibridizați cu plasmida: oligonucleotida trebuie să fie suficient de lungă pentru a permite hibridizarea chiar dacă complementaritatea nu este absolută. Începând de la capetele primerilor, polimeraza specifică va termina apoi sintetizarea filamentului complementar (circular). Prin urmare, la sfârșitul primului ciclu PCR, vor exista plasmide care vor avea o catenă cu mutația (cea care conține primerul cu mutația) și catenă originală, cu o secvență de tip sălbatic. După 25 de cicluri, raportul dintre catene cu mutație și catene fără este de 8 milioane la 1, deci aproape întreaga soluție este alcătuită din plasmide amplificate mutante.
Deși plasmida utilizată ca șablon (fără mutații) este doar una împotriva multor mutanți, este de obicei eliminată prin digestie enzimatică cu enzima de restricție Dpn1, specifică pentru ADN metilat . Enzima va degrada doar copia plasmidei, deoarece a fost inițial metilată, în timp ce o va păstra pe cea mutată care a fost produsă in vitro (și, prin urmare, în absența ADN metilazei ).
Elemente conexe
linkuri externe
- Prelegerea susținută de inventatorul tehnicii cu ocazia recunoașterii Premiului Nobel , pe nobelprize.org .
