Afișarea fagilor

De la Wikipedia, enciclopedia liberă.
Salt la navigare Salt la căutare
Această intrare este orfană
Această intrare despre subiectul biologie este orfană , ceea ce înseamnă că nu există legături de intrare din alte intrări .
Introduceți cel puțin unul relevant și non-generic și eliminați avertismentul. Urmați sfaturile de proiectare de referință .
Schema unui experiment de afișare a fagilor.

Afișarea fagilor este o tehnică de laborator pentru studierea interacțiunilor proteină - proteină , proteină - peptidă și proteină - ADN care folosește bacteriofagi (viruși care infectează bacteriile) pentru a lega proteinele de informațiile genetice care le codifică . [1] Cu această tehnică, gena care codifică proteina de interes este inserată în gena unei proteine ​​de acoperire a fagului , provocând expunerea proteinei în exteriorul fagului, păstrând în același timp gena proteinei în interior, stabilind o legătură între genotip și fenotip . Acești fagi care poartă proteina de interes pot fi apoi selectați cu alte proteine, peptide sau secvențe de ADN cu scopul de a identifica interacțiunile posibile. În acest fel, o cantitate mare de proteine ​​poate fi testată și amplificată într-un proces de selecție in vitro analog selecției naturale .

Cei mai frecvent utilizați bacteriofagi pentru afișarea fagilor sunt fagul M13 și fagul filamentos fd[2] [3] , deși au fost utilizați și fagii T4 [4] și lambda .

Istorie

Tehnica de afișare a fagilor a fost descrisă pentru prima dată în 1985 de George P. Smith, care a demonstrat expunerea unei peptide pe un fag filamentos în urma fuziunii secvenței de codificare a peptidei de interes cu gena III a fagului filamentos. [1] Un brevet din 1985 al lui George Pieczenik descrie, de asemenea, producția de biblioteci pentru afișarea fagilor. [5] Această tehnologie a fost dezvoltată și îmbunătățită în continuare de grupurile de cercetare ale lui Greg Winter și John McCafferty din „Laboratorul de biologie moleculară” din Cambridge , din Lerner și Barbas de la Scripps Research Institute și de Breitling și Dübel din cercetarea germană se concentrează pe tumoare (Deutsches Krebsforschungszentrum) pentru a expune pe lângă peptide și proteine, inclusiv anticorpi .

Principiu

La fel ca în sistemul dual hibrid , afișajul fagului este utilizat pentru screeningul de mare viteză al interacțiunilor proteice. În cazul fagului filamentos M13, ADN-ul care codifică proteina sau peptida de interes este legat în genele pIII sau pVIII, codificând proteina de acoperire majoră sau respectiv minoră. Un polilinker poate fi utilizat pentru a se asigura că fragmentele sunt introduse în toate cele trei chei ADN posibile. Gena fagului și ADN-ul hibrid sunt apoi transduse în celule Escherichia coli (E. coli) cum ar fi TG1, SS320, ER2738 sau XL1-Blue E. coli . Dacă se folosește un vector fagemid , particulele de fagi nu vor fi eliberate din celulele E. coli până când nu sunt infectate cu un ajutor de fag, ceea ce permite ambalarea ADN-ului fagului și asamblarea virionilor maturi cu fragmentul proteic aferent din expune ca parte a capsidei.

Prin imobilizarea unei ținte proteice sau a unei porțiuni de ADN de interes pe suprafața unei fântâni a unei plăci , fagul care expune o proteină care leagă una dintre aceste ținte se va lega de suprafața fântânii, în timp ce celelalte vor fi îndepărtate printr-o spălare . Restul de fagi poate fi apoi eluat și utilizat pentru a produce fagi noi (prin infecție bacteriană cu fagi ajutători) și astfel se produce un amestec de fagi îmbogățit în fagul aferent responsabil de legarea la țintă. Repetarea acestor pași se numește panoramare , cu referire la termenul englezesc referitor la îmbogățirea unei probe de aur cu îndepărtarea materialelor contaminante prin cernere.

Fagii eluați în ultima etapă pot fi folosiți pentru a infecta o gazdă bacteriană adecvată, din care fagemidele pot fi recoltate și secvențele lor de ADN excizate și secvențiate pentru a identifica proteinele care interacționează sau fragmentele de proteine.

Utilizarea fagilor de ajutor poate fi eliminată prin tehnologia liniei celulare de ambalare bacteriană . [6]

Notă

  1. ^ a b G. Smith, Fagul de fuziune filamentoasă: vectori de expresie noi care afișează antigeni clonați pe suprafața virionului , în Știința , vol. 228, nr. 4705, 1985, pp. 1315–1317, DOI : 10.1126 / science.4001944 . Adus la 12 septembrie 2014 .
  2. ^ George P. Smith, Valery A. Petrenko, Phage Display , în Chemical Reviews , voi. 97, nr. 2, 1997, pp. 391-410, DOI : 10.1021 / cr960065d . Adus la 12 septembrie 2014 .
  3. ^ John W. Kehoe, Brian K. Kay, Filamentous Phage Display in the New Millennium , în Chemical Reviews , vol. 105, nr. 11, 2005, pp. 4056–4072, DOI : 10.1021 / cr000261r . Adus la 12 septembrie 2014 .
  4. ^ Naglis Malys, Dau-Yin Chang, Richard G. Baumann, Dongmei Xie, Lindsay W. Black, A Bipartite Bacteriophage T4 SOC and HOC Randomized Peptide Display Library: Detection and Analysis of Fage T4 Terminase (gp17) and Late σ Factor (gp55 ) Interacțiune , în Journal of Molecular Biology , vol. 319, nr. 2, 2002, pp. 289–304, DOI : 10.1016 / S0022-2836 (02) 00298-X . Adus la 12 septembrie 2014 .
  5. ^ (EN) Pieczenik G, Metodă și mijloace de sortare și identificare a informațiilor biologice, US5866363 , United States Patent and Trademark Office , Statele Unite ale Americii [28 august 1985], 2 februarie 1999.
  6. ^ L. Chasteen, J. Ayriss, P. Pavlik, ARM Bradbury, Eliminarea fagului helper de la afișarea fagilor , în Nucleic Acids Research , vol. 34, nr. 21, 2006, pp. e145 - e145, DOI : 10.1093 / nar / gkl772 . Adus la 12 septembrie 2014 .

Alte proiecte

Biologie Portalul de biologie : Accesați intrările Wikipedia care se ocupă de biologie
Adus de la „ https://it.wikipedia.org/w/index.php?title=Phage_display&oldid=113456840 ”