Reacție în lanț a transcriptazei inverse-polimerază
Această intrare sau secțiune despre biologie nu citează sursele necesare sau cei prezenți sunt insuficienți . |
Reacția în lanț a transcriptazei inverse-polimerază (prescurtată RT-PCR ) sau, în limba italiană , reacția în lanț a polimerazei inverse este o variantă a tehnicii reacției în lanț a polimerazei (PCR). Această tehnică constă în sinteza unei molecule de ADN bicatenar pornind de la un șablon de ARN . Molecula de ADN sintetizată prin procesul de transcripție inversă se numește ADNc. Prin utilizarea RT-PCR este posibil să se convertească în ADN un întreg transcriptom (set al întregului transcript al unei celule) al unui țesut specific al unui individ într-o fază specifică a dezvoltării sale. Din acest motiv, RT-PCR este o tehnică care este exploatată în laborator pentru a studia expresia genelor , deoarece permite ADNc sintetizat să fie supus unei analize suplimentare. Produsul retranscrierii ARN, numit și Reacția First-catena, poate fi amplificat prin PCR clasică sau poate fi cuantificat prin PCR în timp real (qPCR) .
Transcriere inversă
ARN total (care conține și ARN ribozomal ) este incubat cu:
- o enzimă ADN polimerază dependentă de ARN, denumită în mod obișnuit transcriptază inversă sau retro-transcriptază.
- deoxiribonucleotide trifosfat ( dNTP ).
- o soluție tampon .
- ioni bivalenți Mg 2 +, care acționează ca cofactori ai polimerazei.
- secvențe de grund .
Secvențele de primer acționează ca primer prin împerecherea complementară cu catena de ARN. Primerii cei mai frecvent utilizați sunt oligos (dT) , care sunt secvențe de oligonucleotide timidine concepute pentru a se împerechea cu coada poliadenilată a ARN-urilor. Dacă, pe de altă parte, doriți să amplificați un eșantion de ARN lipsit de coada de poli adenozină , primerii cei mai potriviți sunt „hexameri aleatori” (în engleză „random hexamers”) sau „random nonamers” (în engleză „random nonamers "): secvențe aleatorii de 6 sau 9 baze care fiind aleatorii pot acționa potențial ca primer pentru orice secvență șablon de ARN. Unii cercetători folosesc o combinație a ambilor grunduri pentru a obține un amestec cu caracteristicile ambilor. Alternativ, este de asemenea posibil să utilizați un primer specific, în cazul în care doriți să transcrieți invers doar un ARN specific.
Grundul oferă un 3’-OH liber care poate fi utilizat de transcriptaza inversă pentru a genera o catenă de ADN complementară transcriptului. Această fază se numește alungire și cursul său este strict dependent de natura enzimei. Există, de asemenea, mai multe opțiuni cu privire la alegerea enzimei. Folosind enzima MMLV (acronim pentru virusul leucemiei de șoarece Moloney, în limba engleză Moloney murine leucemia virus) reacția de alungire trebuie efectuată la 37 ° C, ceea ce este problematic în cazul unui ARN bogat în structuri secundare și / sau GC. O alegere mai bună este enzima Superscript III (acronimul SSIII): este o variantă a enzimei MMLV, proiectată pentru a rezista la temperaturi mai ridicate. În acest caz, reacția se efectuează la 50 ° C timp de aproximativ 1 oră. Enzima SSIII posedă, de asemenea, o activitate RNază H redusă în comparație cu MMLV, ceea ce permite un ADNc mai lung și mai performant.
Odată ce prima catenă este sintetizată, înainte de a continua cu amplificarea ADNc, enzima RNAse (de obicei derivată din bacteria Escherichia coli ) este adăugată la reacția care degradează catena originală de ARN care a fost utilizată ca șablon de transcriptaza inversă.
Amplificare
Când transcrierea inversă este completă, ADNc generat este amplificat printr-o metodă standard PCR .
O ADN polimerază ADN dependentă termostabil , o enzimă cu activitate de polimerază 5 '→ 3' este adăugată la șablonul ADNc și în prezența unei perechi de primeri specifici pentru secvența genei care urmează să fie amplificată, se începe reacția PCR. Dacă secvența nu este disponibilă sau dacă se referă la amplificarea întregului ADN, al doilea primer va fi nespecific, astfel încât să se împerecheze cu sfârșitul primei catene de ADN și cu toate ADNc-urile nou sintetizate.
În primul rând, o moleculă de ADN dublu catenar este sintetizată din molecula de ADNc, conducând reacția la o temperatură adecvată pentru a permite recoacerea primerilor la ADN. Ulterior, aducând temperatura la 95 ° C, noua moleculă de ADN este denaturată și cele două catene astfel separate sunt gata pentru o nouă pereche a primerilor și pentru sinteza de către polimerază, la o nouă scădere a temperaturii (72 ° C aproximativ 1000 pb / minut). După aproximativ 30 de cicluri, vor fi produse milioane de copii ale secvenței de interes.
linkuri externe
- ( EN ) Reacția în lanț a transcriptazei inverse-polimerază , pe Encyclopedia Britannica , Encyclopædia Britannica, Inc.
