Transferul de energie prin rezonanță

Schema FRET: donatorul este excitat de o undă de lumină externă; molecula emite energie care poate fi transmisă acceptorului; dacă acceptorul nu se află la o distanță îngustă, nu există semnal FRET; dacă se află în imediata apropiere, totuși, poate fi detectat un semnal FRET.

Transferul de energie prin rezonanță (sau RET sau FRET , din engleză Förster Resonance Energy Transfer , ^[1] sau EET din engleză Electronic Energy Transfer ) este un fenomen de transfer de energie între fluorofori. Este folosit pentru a determina structurile moleculare ale moleculelor biologice (cum ar fi proteinele , lipidele sau acizii nucleici ) în raport unul cu celălalt. Acest fenomen a fost descris în 1959 de Theodor Förster . ^[2] .

Tehnica spectroscopică care exploatează acest fenomen permite identificarea și caracterizarea distanței dintre două molecule cu precizie extremă. Mecanismul exploatează prezența a două molecule fluorescente , numite donator și acceptor. Donatorul poate fi excitat la o anumită lungime de undă. Această moleculă emite energie care, la rândul ei, poate fi transmisă acceptorului, care este în consecință capabil să emită o fluorescență care poate fi văzută de operator. Acest proces are loc în mod optim numai dacă cele două molecule sunt destul de apropiate.

Aspecte fizice

Termenul FRET, mai corect, se referă la procesul fizic care stă la baza tehnicii. O moleculă (cum ar fi un fluorocrom ), spre care este îndreptată o undă luminoasă, poate absorbi și retransmite energie . Acest lucru se datorează câmpului electric care caracterizează unda (ca radiație electromagnetică), care poate perturbamomentul dipol al moleculei. Această perturbație, mai detaliată, constă în transferul unei anumite cantități de energie către moleculă, făcându-l concret excitat . Această stare de excitație nu poate dura mult timp (din diverse motive, inclusiv principiul incertitudinii Heisenberg ), dar se degradează, aducând fluorocromul la starea electronică fundamentală și emițând un foton cu energie ușor mai mică decât energia absorbită inițial (și, pe baza relația ν = c / λ, la o lungime de undă mai mare λ).

Acest lucru poate fi explicat și prin luarea în considerare a timpilor de absorbție și de emisie. Momentul proceselor de absorbție este de fapt de ordinul a 10 ^-15 s, iar cea a re-emisia luminii (fluorescenta) este cuprins între 10 ^-12 s si 10 ^-7 s. Starea excitată (între absorbție și reemisie) are deci o anumită durată, în cadrul căreia pot apărea numeroase procese. Moleculele de solvent (și substanțele dizolvate ) prezente în jurul fluorocromului, de exemplu, își pot schimba considerabil dispunerea. În consecință, se poate spune că procesul de fluorescență reflectă ceea ce se întâmplă cu și în jurul moleculei în timpul șederii sale în starea excitată.

Fiecare moleculă are un spectru de absorbție și emisie foarte specific. Aceasta înseamnă că proprietățile de absorbție sau de emisie ale moleculei (și în special energia legată de cele două procese) variază considerabil în funcție de valoarea λ a undei luminoase „incidente”. Fiecare moleculă, în special, are o absorbție și o emisie „optimă” λ, la care absoarbe și emite cu intensitate maximă.

Conceptul de FRET

FRET constă în esență în efectul combinat al două molecule capabile să emită fluorescență în urma unei excitații, după cum sa raportat în paragraful anterior.

Spectrele de absorbție și emisie ale proteinei fluorescente cyan (respectiv în albastru și albastru deschis) și a proteinei fluorescente galbene (în verde și galben). Regiunea suprapunerii dintre emisia de CFP și absorbția YFP este evidențiată în gri.

Spre unul dintre acești doi „ fluorofori ”, numit donator, o undă luminoasă este direcționată către un anumit λ (de obicei, cel relativ la vârful său de absorbție). Donatorul excitat poate emite fluorescență în funcție de spectrul său tipic de emisie. Dacă spectrul de emisie al donorului se suprapune în mod consecvent cu cel de absorbție a acceptorului (adică dacă salturile de energie asociate celor două procese sunt similare), donatorul excitat nu emite lumină, ci „trece” excitația într-un acceptor rezonant (mai mult sau mai puțin eficient), ceea ce va da cât de strălucitoare este lungimea de undă caracteristică. În imaginea laterală, donatorul este CFP ( Cyan Fluorescent Protein ), acceptorul YFP (o variantă a proteinei fluorescente galbene ): spectrul de emisie al CFP și spectrul de absorbție al YFP se suprapun pe scară largă între 450 și 550 nm (gri zona), deci aceasta este o bună pereche de molecule utilizabile în FRET.

Dacă, pe de o parte, suprapunerea acestor două spectre trebuie să fie mare (altfel transferul de energie ar fi zero), este necesar, dimpotrivă, ca cele două spectre de emisie să nu fie suprapuse: dacă se întâmplă acest lucru, detectarea emisia acceptorului ar prezenta un zgomot ridicat de fond în raport cu emisia simultană a donatorului. De asemenea, este esențial ca cele două spectre donatoare să nu fie suprapuse, pentru a evita fenomenele de autotransfer de energie între diferite molecule donatoare prezente în soluție. Concentrația celor doi fluorofori în soluție trebuie, de asemenea, controlată: cele mai bune rezultate se obțin de obicei cu o concentrație limitată de donatori și o concentrație mult mai mare de acceptori (cu situația limită a multor acceptori din jurul unui singur donator).

Energia transferată între cei doi fluorofori nu este, așa cum s-ar putea crede, de tipul luminos (adică electromagnetic ). Mai mult, transferul de energie luminoasă ar fi prea dependent de proprietățile optice ale solventului, ceea ce face tehnica FRET mai dificilă. În schimb, transferul are loc prin interacțiuni simple pe distanță lungă dipol-dipol. Conform acestui principiu, fluoroforul excitat poate fi înțeles ca un dipol oscilant, capabil să transfere energie la un al doilea dipol având o frecvență rezonantă similară. Transferul de energie prin rezonanță nu este sensibil la tipul de solvent în care se găsește proba: comparativ cu un transfer de energie luminoasă, de fapt, acest proces depinde exclusiv de distanța dintre molecule și nu de caracteristicile mediu pentru a trece. O confirmare suplimentară a caracterului non-electromagnetic al transferului constă în dovada că FRET poate avea loc chiar și fără ca donatorul să poată emite fluorescență: este suficient să absoarbă și să emită energie pentru ca acceptorul să absoarbă și să emită fluorescență.

Donatorul este entuziasmat și absoarbe energie (linia albastră); atunci când o eliberează (linia albastră), o parte din energie este transmisă acceptorului care absoarbe (verde) și re-emite (galben) la rândul său

Acest proces este bine conturat în imaginea din lateral, care rezumă diferiții pași ai FRET:

donatorul absoarbe energia din unda de lumină și atinge o stare excitată (linia albastră continuă);
donatorul poate emite fluorescență (linie roșie) sau emite o cantitate redusă (linie albastră întreruptă), transferând prin rezonanță restul energiei asociate cu coborârea din starea excitată (linia neagră); mai exact, atunci când acceptorul este suficient de aproape pentru ca transferul de energie să aibă loc, perturba fluorescența donatorului (cunoscut sub numele de fenomen de „ stingere ”);
prin acest transfer de energie de origine neluminată, acceptorul poate absorbi (linia verde punctată);
acceptorul produce fluorescență (linie galbenă continuă).

Este important să se acorde atenție faptului că energia emisă de donator este mai mică decât cea absorbită anterior (datorită fenomenelor vibraționale deja descrise) și mai mare decât cea pe care acceptorul o va absorbi, care la rândul ei va putea emite la o energie și mai mică. Săgețile verticale din figură, de fapt, sunt mai scurte pe măsură ce vă deplasați spre dreapta.

Măsurători ale FRET

Fenomenul FRET poate fi observat în două moduri diferite. Un prim tip de detectare posibilă este cel al luminii emise la emisia maximă λ a acceptorului. După cum vom vedea, intensitatea acestei lumini depinde de eficiența procesului și, în special, de distanța dintre cele două molecule. Această detectare este adesea utilizată în studii „statice”, în care distanța dintre moleculele examinate nu se schimbă: prin această abordare, este posibil să se utilizeze FRET ca o regulă moleculară , un fel de „regulă moleculară”. O abordare dezvoltată mai recent, dar care câștigă popularitate din ce în ce mai mare, constă în obținerea de informații relevante prin măsurarea timpului de înjumătățire al colorantului donator în prezența și absența acceptorului. Este utilizat în cazurile în care distanța dintre cele două molecule nu este constantă (de exemplu, în studiile de pliere a proteinelor ).

Eficiența FRET

Eficiența procesului depinde în mod evident de distanța dintre cei doi fluorofori: fluorescența este cu atât mai evidentă cu cât moleculele sunt mai apropiate. Distanțele tipice ale unui proces FRET sunt de ordinul a zeci de ångström . Eficiența ( E ) a FRET este definită ca:

E=1-{F'_{\rm {D}}}/{F_{\rm {D}}}

{\ displaystyle E = 1- {F '_ {\ rm {D}}} / {F _ {\ rm {D}}}}

E = 1 - {F '_ {\ rm D}} / {F _ {\ rm D}}

F ' _D și F _D reprezintă intensitatea fluorescenței donatorului în prezența sau absența unui acceptor. Pentru ca eficiența să fie maximă (egală cu 1), este necesar la limita ca toată energia emisă de donator să fie transmisă de FRET către acceptor (adică F ' _D este egal cu zero). Pentru ca acest lucru să se întâmple, cele două molecule trebuie să fie apropiate între ele: și, de fapt, depinde de distanța dintre donator și acceptor conform legii

E={\frac {1}{(1+(r/R_{0})^{6})}}

{\ displaystyle E = {\ frac {1} {(1+ (r / R_ {0}) ^ {6})}}}

E = \ frac {1} {(1+ (r / R_0) ^ 6)}

Distanța dintre molecule este notată cu r . Pe de altă parte, R ₀ indică distanța critică Förster, un parametru legat de caracteristicile particulare ale perechii de molecule. R ₀ oscilează de obicei între 2 și 6 nm, ceea ce reprezintă (din fericire) o distanță foarte interesantă pentru efectuarea de studii asupra macromoleculelor biologice. Este foarte util să cunoașteți R ₀ a perechilor de molecule, mai presus de toate, pentru a avea un criteriu precis pentru alegerea celor mai buni fluorofori pentru tipul de studiu care este înființat. În imaginea prezentată, este evidențiată relația dintre distanța dintre molecule și eficiența FRET. Prin urmare, se poate observa că R ₀ este definit ca distanța la care FRET are o eficiență de 50%. R ₀ poate fi de fapt calculat prin relația:

{R_{0}}^{6}=8.8\times 10^{23}\;\kappa ^{2}\,n^{-4}\,Q_{0}\,J

{\ displaystyle {R_ {0}} ^ {6} = 8,8 \ times 10 ^ {23} \; \ kappa ^ {2} \, n ^ {- 4} \, Q_ {0} \, J}

{R_0} ^ 6 = 8,8 \ ori 10 ^ {23} \; \ kappa ^ 2 \, n ^ {- 4} \, Q_0 \, J

Cu κ indicăm factorul de orientare al dipolului (în funcție de libertatea de rotație a moleculelor), cu n indicele de refracție al soluției, cu Q ₀ cantitatea de fluorescență pe care donatorul o emite în absența unui acceptor. În cele din urmă, J este rezultatul următoarei integrale, în care f _D (λ) este funcția spectrului de emisie normalizat al donatorului și ε _A (λ) coeficientul de extincție al acceptorului:

J=\int f_{\rm {D}}(\lambda )\,\epsilon _{\rm {A}}(\lambda )\,\lambda ^{4}\,d\lambda

{\ displaystyle J = \ int f _ {\ rm {D}} (\ lambda) \, \ epsilon _ {\ rm {A}} (\ lambda) \, \ lambda ^ {4} \, d \ lambda}

J = \ int f _ {\ rm D} (\ lambda) \, \ epsilon _ {\ rm A} (\ lambda) \, \ lambda ^ 4 \, d \ lambda

Prin urmare, măsurând eficiența FRET, operatorul este capabil să obțină distanța donator-acceptor.

Aplicații de bază

Aplicațiile principale ale FRET constau în esență în utilizarea celor doi fluorofori ca etichete pentru identificarea și studiul a două molecule de interes care, ipotetic, se află în imediata apropiere. Ideea de bază constă în excitarea donatorului printr-o undă de lumină controlată de operator, prin urmare, în observarea probei la un λ compatibil cu emisia acceptorului (de obicei la λ în raport cu vârful său de emisie). Această analiză este posibilă utilizând echipamente specifice pentru observarea optică, cum ar fi un microscop, un laser confocal. Prin acest microscop, de fapt, este posibil să se excite (printr-un laser ) doar donatorul și să se identifice cu precizie emisia acceptorului, eliminând cea mai mare parte a zgomotului de fond prin filtre speciale. Mai mult, analiza unui microscop confocal este în timp real: acest lucru permite utilizarea acestor dispozitive și pentru studii dinamice, care exploatează și datele privind timpul de înjumătățire al speciilor fluorescente. Principala limitare a microscopului confocal în utilizarea acestuia în FRET constă în numărul limitat de λ excitabil, care restricționează efectiv numărul de fluorofori utilizabili. O limitare intrinsecă a FRET, pe de altă parte, constă în prezența fenomenelor de albire fotovoltaică (legate intrinsec de excitația pe care operatorul o operează din exterior pe donator) și a autofluorescenței (datorită fluorescenței deja prezente, deși în foarte scăzută cantități, în eșantionul biologic luat în considerare), care nu pot fi întotdeauna eliminate.

Fluorofori utilizați

Fluoroforii cei mai utilizați în FRET sunt cei din familia GFP ( Green Fluorescent Protein ). Acestea sunt molecule de proteine mult mai ușor de gestionat decât fluoroforii organici clasici (care prezintă probleme considerabile de purificare, modificare chimică și injecții intracelulare). GFP (și moleculele derivate din acesta, RFP care emite în roșu, BFP și CFP în albastru, YFP în galben) pot fi de fapt fuzionate cu proteina care trebuie monitorizată prin tehnologii de inginerie genetică , făcând testul mult mai ușor de realizat. Prezența emiterii de FP la diferite λ le permite să fie utilizate în perechi pentru a efectua FRET (foarte utilizat, în special, GFP în asociere cu BFP).

Aplicații în biologia celulară și moleculară

FRET permite monitorizarea variațiilor conformaționale din cadrul unei singure proteine (figura a) sau a interacțiunilor dintre diferite proteine, de exemplu receptorii de membrană (figura b)

FRET este un instrument util în cuantificarea interacțiunilor dintre macromoleculele biologice (proteină-proteină, acid proteic-nucleic, proteină-lipidă). Pentru a monitoriza modificările conformaționale din cadrul macromoleculei, de exemplu, este posibil să o marcați în două site-uri diferite, la o distanță mai mare de 10 nm: dacă proteina schimbă conformația, apropiindu-se de cele două site-uri, FRET poate avea loc și este capabil să dea un semnal . Dacă schimbarea conformațională se datorează interacțiunii cu un ligand, este posibil, în amonte, să plasați unul dintre cei doi fluorofori direct pe ligand. În secțiunea a figurii, un exemplu de schimbare conformațională este vizibilă, aducând cele două fluorofore mai aproape. În acest caz, apare FRET și operatorul localizează un semnal prin excitarea donatorului și detectarea fluorescenței la vârful spectrului acceptor (YFP). Secțiunea b din figură arată o abordare FRET pentru studierea interacțiunilor dintre două proteine. Primul este asociat cu BFP (donator), al doilea cu YFP (acceptor). Dacă cele două proteine nu sunt asociate unele cu altele, nu este detectabil niciun semnal FRET. Cu toate acestea, dacă cele două proteine sunt asociate, operatorul va identifica un semnal FRET (la vârful emisiei YFP).

Tehnica FRET este acum utilizată pe scară largă în biologia moleculară și celulară , chiar și pentru teste mult mai complexe, care se referă la cercetarea activității proteazei , a modificărilor potențialelor membranei , a metabolismului calciului și a expresiei genice a celulelor . De asemenea, găsește o aplicație largă în eseurile foarte frecvente în timp real de PCR .

FRET este, de asemenea, un instrument util în cuantificarea interacțiunilor dintre macromoleculele biologice. Conceptul de FRET se află, de fapt, la baza tehnicilor precum PCR în timp real , în special în cele care utilizează sonde LightCycler, la care un donator și un acceptor FRET sunt conjugați. Acceptatorul fluoresc numai dacă cele două sonde apar aproape una de alta.

Una dintre cele mai surprinzătoare aplicații ale FRET în ultimii ani a fost dezvoltarea de nanosenzori capabili să vizualizeze concentrația unor biomolecule in vivo în celule, prin intermediul microscopiei cu fluorescență ^[3] . Acest lucru a permis pentru prima dată vizualizarea directă a fenomenelor precum transportul prin membrană a unor ioni , carbohidrați și aminoacizi . Nanosenzorul este un lanț polipeptidic lung format din două proteine fluorescente, ca în cazurile de mai sus, de această dată legate covalent de un receptor pentru metabolitul care urmează să fie identificat. Deoarece sunt cunoscuți numeroși receptori solubili bacterieni, este posibil să se aplice tehnica diferitelor substanțe recunoscute în mod specific de acești receptori. Prin modificări direcționate în secvența de aminoacizi a receptorilor este, de asemenea, posibil să se modifice specificitatea prin construirea de noi nanosenzori.

Notă

^(RO) IUPAC Gold Book, "Förster-rezonanță-transfer de energie FRET"
^ ( DE ) Förster T., Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz, Ann. Physik 1948 , 437 , 55. DOI : 10.1002 / andp.19484370105
^ Marcus Fehr, Wolf B. Frommer și Sylvie Lalonde. Vizualizarea captării maltozei în celulele de drojdie vii de către nanosenzori fluorescenți PNAS 2002 vol. 99 p. 9846-9851; doi 10.1073 / pnas.142089199

Bibliografie

( RO ) Joseph R. Lakowicz, „Principiile spectroscopiei fluorescenței”, Plenum Publishing Corporation, ediția a II-a (1 iulie 1999)
Peter Atkins, Julio De Paula, Chimie fizică , ediția a IV-a, Bologna, Zanichelli, septembrie 2004, ISBN 88-08-09649-1 .

Alte proiecte

Wikimedia Commons conține imagini sau alte fișiere despre Transferul de energie prin rezonanță

Portalul de biologie

Portalul chimiei

[1] (RO) IUPAC Gold Book, "Förster-rezonanță-transfer de energie FRET"

[2] ( DE ) Förster T., Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz, Ann. Physik 1948 , 437 , 55. DOI : 10.1002 / andp.19484370105

[3] Marcus Fehr, Wolf B. Frommer și Sylvie Lalonde. Vizualizarea captării maltozei în celulele de drojdie vii de către nanosenzori fluorescenți PNAS 2002 vol. 99 p. 9846-9851; doi 10.1073 / pnas.142089199

[1]

[2]

[3]