Miniprep
Miniprep (sau miniprepararea ADN-ului plasmidic) este o tehnică de laborator utilizată în biologia moleculară pentru extracția la scară mică a ADN-ului plasmidic din bacteriile transformate care îl conțin. Miniprepurile sunt utilizate în timpul proceselor de clonare pentru a analiza clonele bacteriene.
Utilizare
Utilizarea plasmidelor face posibilă reproducerea materialului genetic în bacterii sau transferul anumitor gene către alte organisme. Randamentul plasmidelor depinde de numeroși factori: tulpina bacteriană, mediul de cultură utilizat, tipul de plasmidă (așa-numitul număr mare de copii , număr mare de copii sau număr mic de copii , plasmide cu număr mic de copii ) și condițiile de cultură ( agitare, temperatura ...). Bacteriile utilizate în general pentru replicarea plasmidelor exogene sunt din specia Escherichia coli .
Această tehnică este utilă atunci când plasmidele trebuie utilizate ca vectori de expresie sau de clonare , pentru a determina, în general, după o ligare și o etapă de transformare ulterioară, ce clone bacteriene conțin plasmida de interes.
Metodă
Există mai multe modalități de a obține un miniprep: metoda clasică folosește o serie întreagă de soluții sau tampoane care sunt utilizate pentru a efectua diferitele etape ale extracției (de la ruperea celulelor la obținerea ADN-ului plasmidic). Această tehnică se bazează pe procesul de liză alcalină , propus de Birnboim și Doly în 1979. [1]
În prezent, în laboratoarele de cercetare se folosesc truse furnizate de diverse industrii din sector care conțin, deja pregătite, soluțiile pentru extracția ADN-ului; din motive comerciale, nu se cunoaște compoziția fiecărei soluții individuale.
Creșterea bacteriilor
Plasmidele sunt de obicei purificate din culturi lichide transformate, însămânțate pe mediu solid și izolate. Plasmidele proiectate sunt de obicei dotate cu una sau mai multe gene capabile să confere rezistență la antibiotice (de obicei ampicilină sau kanamicină ), ceea ce permite bacteriilor care au fost transformate cu succes să se înmulțească într-un mediu de cultură selectiv. În minipreps volumul mediu lichid este de aproximativ 1-5 ml.
Liza
Bacteriile din fiecare probă, după ce au fost resuspendate într-un tampon izotonic, suferă o liză alcalină datorită adăugării unui tampon care conține 0,2 N hidroxid de sodiu și neutralizare ulterioară cu adăugarea unui tampon care conține acetat de sodiu . Hidroxidul de sodiu, pe lângă ruperea peretelui bacterian, denaturează ADN-ul . Faza de neutralizare, restabilind pH - ul la valori fiziologice, permite renaturarea ADN-ului plasmidic supraînfășurat, dar nu și a celui genomic, datorită dimensiunii mari a acestuia din urmă. [1]
Purificarea ADN-ului
După centrifugarea probelor, care îndepărtează membranele, pereții celulari și ADN-ul genomic, ADN-ul plasmidic în soluție este purificat prin adăugarea unei soluții de fenol / cloroform : proteinele sunt denaturate și solubilizate în faza organică inferioară în timp ce plasmida ADN este plasată în faza apoasă superioară.
Faza apoasă este îndepărtată și ADN-ul este precipitat prin adăugarea de etanol . După precipitare, etanolul este îndepărtat și ADN-ul precipitat poate fi resuspendat în apă sau într-un alt tampon adecvat.
O altă metodă de purificare apare cu separarea ADN-ului pe un gradient CsCl-EtBr.
