Microscop de fluorescență

De la Wikipedia, enciclopedia liberă.
Salt la navigare Salt la căutare
Schiță
Această intrare pe tema opticii este doar o schiță .
Contribuiți la îmbunătățirea acestuia în conformitate cu convențiile Wikipedia .
Un microscop cu fluorescență (Olympus BX61), cuplat la o cameră digitală.

Un microscop cu fluorescență este un microscop optic utilizat pentru a studia probe organice sau anorganice prin exploatarea fenomenelor de fluorescență și fosforescență induse în probă. Microscoapele optice tradiționale, pe de altă parte, exploatează fenomene precum reflectarea sau absorbția luminii care luminează direct proba eșantionată. [1] [2]

Un microscop cu fluorescență inversat (Nikon TE2000). Rețineți platforma portocalie care permite operatorului să vadă eșantionul, dar îl protejează și de lumina UV utilizată pentru excitație.

Tehnica

Primele utilizări practice ale tehnicii au venit din experiența legată de utilizarea luminii ultraviolete în observarea probelor microscopice. Problemele care decurg din utilizarea lungimilor de undă invizibile pentru ochiul uman au îndreptat curând atenția către observarea fenomenelor de fluorescență induse în probă de aceleași radiații. Utilizările ulterioare au trecut prin observarea preparatelor susceptibile în mod natural la fluorescență, în general cu instrumente cu lumină transmisă, dar în timp, din diferite motive inerente opticii instrumentale, a fost utilizat microscopul cu epifluorescență , sursa nealiniindu-se cu „observatorul”. Următorul pas a fost marcarea probelor non-fluorescente și utilizarea lungimilor de undă nu neapărat în spectrul UV.
În cea mai răspândită utilizare în prezent, componenta de interes pentru probă este etichetată în mod specific cu o moleculă fluorescentă, numită fluorofor (unele exemple sunt GFP , fluoresceina sau DyLight Fluor ). [1] Proba este apoi iluminată cu un fascicul de lumină cu o lungime de undă specifică, care este absorbită de fluorofor, determinând-o să emită lumină la lungimi de undă mai mari (și, prin urmare, de o culoare diferită de lumina absorbită). Lumina incitantă este separată de lumina emisă, care este mult mai slabă, datorită utilizării unui filtru. Componentele tipice ale microscopului cu fluorescență sunt: ​​o sursă de lumină ( lampă cu arc de xenon sau vapori de mercur sau LED de mare putere), un filtru de excitație, o oglindă dicroică , un filtru de emisie. Filtrele și oglinzile dicroice sunt alese pe baza caracteristicilor de excitație și emisie ale fluoroforului utilizat; [1] în acest fel puteți observa o singură culoare la un moment dat. De asemenea, puteți compune imagini multicolore combinând imagini cu o singură culoare, realizate cu fluorofori diferiți. [1]

Majoritatea microscopilor de fluorescență utilizați sunt microscopi de epifluorescență, în care excitația și observarea fluorescenței au loc de deasupra ( epi– ) eșantionului și, în orice caz, de pe axa în raport cu observatorul. Aceste microscopuri au devenit instrumente importante în domeniul biologiei, deschizând, de asemenea, ușile către proiectarea unor microscopii din ce în ce mai avansate și complexe, cum ar fi microscopul confocal și TIRF (Microscopul cu fluorescență cu reflecție internă totală). În cele din urmă, Vertico SMI combină microscopia cu modularea spațială a iluminării, ajungând la rezoluții liniare sub 10 nanometri (1 nanometru = 1 nm = 1 × 10 −9 m). [3] [4] [5] .

Fluoroforii își pot pierde caracteristicile de fluorescență atunci când sunt iluminate; procesul se numește fotoblanșare . Pentru a evita fotoblanșarea, pot fi luate mai multe măsuri: de exemplu, pot fi utilizați fluorofori mai puternici, iluminarea poate fi redusă la minimum sau, alternativ, poate fi utilizat un anumit tip de reacție chimică , cunoscută sub numele de chimie scavenger. [ neclar ] .

Microscopie epifluorescentă

Imagine schematică a unui microscop cu fluorescență.

Microscopia cu epifluorescență este o metodă specială de microscopie cu fluorescență, utilizată pe scară largă în domeniul biologiei . Lumina de excitație vine de deasupra eșantionului (sau de dedesubt, în microscopuri inversate) și trece mai întâi prin obiectiv , apoi eșantionul în sine. Fluorescența care provine din eșantion creează așa-numita lumină de emisie, care este focalizată pe un detector de același obiectiv prin care a trecut fasciculul de excitație. Lumina de excitație este îndepărtată din semnalul emis de probă printr-un filtru, plasat între obiectiv și detector.

Galerie de imagini

  • Celulele endoteliale la microscopul cu fluorescență. Nucleii sunt evidențiați în albastru cu DAPI , microtubulii în verde cu un anticorp legat de FITC și filamentele de actină sunt marcate în roșu cu faloidină conjugată cu TRITC . Celulele arterei pulmonare bovine.

  • Nucleul unui limfocit uman colorat cu DAPI ; sunt vizibili centromerii cromozomilor 13 (verde) și 21 (roșu), evidențiați prin tehnica FISH ( Fluorescent In Situ Hybridization )

  • Membrane celulare de drojdie vizualizate de proteine ​​de membrană fuzionate cu RFP ( Red Fluorescent Protein ) sau GFP (" Green Fluorescent Protein "). Suprapunerea luminii emise de ambele proteine ​​fluorescente este de culoare galbenă.

  • Super rezoluție GFP cu microscopul Vertico SMI Christoph Cremer

  • Localizarea moleculelor YFP într-o celulă (distanță de 15 nm) Tehnologia SPDMphymod

  • Colocalizarea moleculelor GFP și RFP (120.000 molecule) tehnologia 2CLM

Notă

  1. ^ a b c d Spring KR, Davidson MW, Introducere în microscopie fluorescentă , în Nikon Microscopy U. Adus 28-09-2008 .
  2. ^ Microscopul de fluorescență , în Microscoape - Ajutați oamenii de știință să exploreze lumile ascunse , Fundația Nobel. Adus 28-09-2008 .
  3. ^ Analiza nanostructurii folosind microscopia de iluminare modulată spațial: D. Baddeley, C. Batram, Y. Weiland, C. Cremer, UJ Birk în NATURE PROTOCOLS, Vol 2, pp. 2640-2646 (2007)
  4. ^ Analiza structurală de înaltă precizie a complexelor subnucleare din celulele fixe și vii prin microscopie cu iluminare modulată spațial (SMI): J. Reymann, D. Baddeley, P. Lemmer, W. Stadter, T. Jegou, K. Rippe, C. Cremer , U. Birk în CHROMOSOME RESEARCH, Vol. 16, pp. 367 - 382 (2008)
  5. ^ SPDM - Microscopie ușoară cu rezoluție de moleculă unică la nano-scară: P. Lemmer, M. Gunkel, D. Baddeley, R. Kaufmann, A. Urich, Y. Weiland, J.Reymann, P. Müller, M. Hausmann, C Cremer în FIZICA APLICATĂ B, Vol 93, pp. 1-12 (2008).

Alte surse

  • Bradbury, S. și Evennett, P., Microscopie cu fluorescență, Tehnici de contrast în microscopie cu lumină., BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford, Regatul Unit (1996).
  • Rost, F., Microscopie cu fluorescență cantitativă. Cambridge University Press, Cambridge, Regatul Unit (1991).
  • Rost, F., Microscopie fluorescentă. Vol. I. Cambridge University Press, Cambridge, Regatul Unit (1992). Retipărit cu actualizare, 1996.
  • Rost, F., Microscopie fluorescentă. Vol. II. Cambridge University Press, Cambridge, Regatul Unit (1995).
  • Rost, F. și Oldfield, R., Microscopie fluorescentă., Fotografie cu microscop, Cambridge University Press, Cambridge, Regatul Unit (2000).

Alte proiecte

linkuri externe

Controlul autorității Tezaur BNCF 22239 · LCCN (EN) sh85049410 · GND (DE) 4290958-2 · BNF (FR) cb12262191x (data)
Adus de la „ https://it.wikipedia.org/w/index.php?title=Microscope_a_fluorescence&oldid=117490901 ”