Microscop confocal

Microscop de fluorescență confocal, plasat pe o masă optică și închis într-o cutie de plexiglas care funcționează ca un incubator .

Microscopul confocal este un microscop optic, un instrument științific care se bazează pe o tehnologie care vizează creșterea semnificativă a rezoluției spațiale a eșantionului, eliminând halourile datorate luminii difuzate de planurile nefocalizate ale preparatului. ^[1]

Bazele teoretice ale instrumentului, în sens larg, au fost puse la mijlocul anilor cincizeci de către omul de știință activ în domeniul inteligenței artificiale , Marvin Lee Minsky .
Primele aparate proiectate, construite și diseminate efectiv în domeniul aplicațiilor au fost microscopurile cu tehnologie CSLM, construite în Regatul Unit la începutul anilor nouăzeci și inițial comercializate de compania Bio-Rad, pe baza cercetărilor și prototipurilor efectuate la Laboratorul MRC of Molecular Biology.de Cambridge de William Bradshaw Amos ^[2] în anii 1980 .

Caracteristici generale

Măsurarea unei stele pe o monedă de un euro, obținută cu ajutorul unui microscop de reflexie confocal.

Instrumentul funcționează în câmpul convențional de măriri ale microscopiei optice normale și este constituit schematic de un microscop de transmisie normal pe care este suprapus un aparat care este responsabil pentru iluminarea și detectarea imaginii unei probe iluminate cu o scanare punct-la-punct .

Există mai multe tehnici pentru a realiza acest lucru: discul Nipkow , Microscoape cu matrice programabilă (PAM) și laser. Ultimul tip, cel mai răspândit și numit CLSM, acronim pentru microscopul de scanare laser confocal , este un microscop avansat de fluorescență care vă permite să focalizați un laser pe specimen cu o precizie extremă, crescând semnificativ rezoluția și adâncimea de câmp.

Sursa sa de lumină constă din unul sau mai multe lasere, în general lasere semiconductoare, pentru fiecare frecvență de excitație necesară. Mecanismul de direcție a fasciculului de lumină este gestionat de sisteme computerizate. Imaginile obținute, sincronizând dispozitivul de detectare cu fasciculul de excitație, sunt deosebit de definite și spectaculoase și pot permite diferitelor molecule prezente în preparat să fie evidențiate cu culori diferite, permițându-i să apreciem tridimensionalitatea acestuia (exemplu deosebit de apreciat în pe teren, utilizând tehnici de imunofluorescență , fotomicrografie laterală cu actină în roșu, tubulină cito- scheletică în verde și ADN nucleu în albastru).

Istorie

Calea optică a unui microscop confocal, de reflecție și transmisie, preluată din brevetul lui Marvin Minsky (1957).

Minsky a realizat primul microscop confocal în 1955, în timp ce lucra, ca membru al Harvard Society of Fellows , la o metodă de colectare a imaginilor clare ale țesutului neuronal dens.

Tehnicile tradiționale disponibile la acea vreme nu obțineau decât o strălucire difuză, datorită luminii difractate din planurile ne-focalizate: densitatea mare a celulelor nervoase interconectate, marcate cu fluorocromi și toate iluminate în același mod, au determinat lentila să colectează prea multă radiație. nedorite, reducând semnificativ raportul semnal-zgomot .

Ideea decisivă a fost de a ilumina selectiv doar un singur punct de obiect la un moment dat și de a muta acest punct pe planul focal, scanându-l în cele două direcții ale planului de obiect pentru a crea imaginea finală.

Designul original al lui Minsky avea un obiectiv identic cu obiectivul în locul obiectivului condensator , în timp ce iluminarea, asigurată de o lampă de zirconiu, era limitată de un orificiu . Imaginea redusă a acestuia din urmă a fost focalizată pe obiect, creând un singur disc luminos. Un al doilea orificiu plasat între lentilă și fotomultiplicatorul de detectare a ajutat la eliminarea oricărei lumini împrăștiate din planurile nefocalizate.

Prin urmare, ne confruntăm cu o geometrie simetrică, simplă și elegantă ^[3] .

Sistemul de scanare a asigurat mișcarea eșantionului datorită celor două tije oscilante din metal elastic, plasate ortogonal și controlate de electro-magneți. Variația intensității luminii, modulată de probă și tradusă în fotocurent, a creat imaginea finală grație unui tub catodic de lungă durată ^[4] .

Principiul de funcționare

Structura schematică esențială a unui microscop reflector confocal; pentru simplitate, ocularul a fost omis, poziționând detectorul în punctul de formare a imaginii intermediare.
Procesul de formare a imaginii este inspirat din brevetul original al lui Minsky, unde se exploatează iluminarea critică.

Metoda de formare a imaginii într-un microscop confocal diferă de cea a unui microscop compus convențional prin aceea că, în timp ce în cel de-al doilea fasciculul de iluminare lovește întreaga probă și formează instantaneu imaginea de pe detector, în primul lumina care vine de la sursă iluminează obiectul doar un punct la un moment dat și este necesară o scanare pentru a forma imaginea finală. Utilizarea acestei tehnici permite atingerea unor rezoluții axiale foarte mici. De fapt, o imagine astfel obținută este denumită în mod obișnuit „secțiune optică”, cu referire la faptul că este posibil să se investigheze proba în cele trei dimensiuni spațiale cu o metodă neinvazivă.

În microscopia confocală, punctul luminos punctual este produs de un orificiu plasat în fața sursei, adică pentru a înlocui diafragma de câmp, care este astfel fixă și foarte mică. Lumina este apoi focalizată de colector și condensator (sau de obiectiv, în cazul configurației luminii reflectate) asupra eșantionului, pentru a fi apoi colectată de obiectiv și de ocular posibil și concentrată pe un al doilea orificiu. În corespondență cu acesta există și detectorul de imagine, care produce un semnal proporțional cu intensitatea luminii care îl lovește.

Gura de iluminare și gaura de revelație aparțin planurilor focale conjugate și sunt, prin urmare, numite confocale , de unde și numele acestei tehnici microscopice.

Aproape toate sistemele confocale moderne folosesc configurația luminii reflectate, care, așa cum era anticipat de Minsky însuși, crește simetria și rezoluția sistemului în detrimentul luminozității, care este redusă datorită prezenței oglinzii dicroice sau a splitterului de fascicul.

Structura schematică esențială a unui microscop reflector confocal; pentru simplitate, ocularul a fost omis, poziționând detectorul în punctul de formare a imaginii intermediare.

Confocalitatea și principiul lui Köhler

Trebuie remarcat faptul că confocalitatea și principiul lui Köhler intervin asupra diferitelor aspecte ale structurii unui microscop și, cel puțin teoretic, acestea nu sunt în conflict: respectarea principiului lui Köhler determină existența a două seturi distincte de planuri focale conjugate și a consecințelor posibilitatea de a regla independent câmpurile și diafragmele, datorită diafragmelor poziționate în puncte ușor identificabile ale axei optice; confocalitatea, pe de altă parte, implică îngustarea extremă a câmpurilor microscopului, obținerea unei reduceri drastice a luminii difuzate de planurile nefocalizate și o creștere considerabilă a rezoluției axiale, grație scăderii adâncimii aparente de câmp.

La nivel practic, din păcate, respectarea principiului Köhler într-un microscop confocal este foarte problematică. Orificiile constituie un obstacol în calea trecerii luminii și soluția care apare spontan ar consta în focalizarea ei exact în punctul în care sunt poziționate. Totuși, acest lucru nu este posibil, deoarece în acest fel sursa ar fi concentrată asupra obiectului, al cărui plan este conjugat cu cel al orificiilor. Prin urmare, este necesar să se încerce să se obțină o grindă colimată atât de îngustă încât să treacă prin orificii cu pierderi neglijabile: o problemă dificilă, mai ales atunci când dimensiunile implicate sunt apropiate de limitele de difracție ale instrumentului. Din fericire, deoarece câmpul obiectului este în mod ideal punctiform, adică cu un diametru ideal infinitesimal, problema uniformității iluminării nu este la fel de gravă ca în microscopia tradițională și, cu prudență, se poate adopta iluminarea critică .

Rezoluție confocală laterală

Se definesc singuri

$r$ ${\ displaystyle r}$ $r$ : coordonată radială pe planul de formare a imaginii ( $r=0$ ${\ displaystyle r = 0}$ $r = 0$ la punctul de intersecție între planul de imagine și axa optică a sistemului)
$Nu. LA$ ${\ displaystyle NA}$ ${\ displaystyle NA}$ : diafragma numerică a obiectivului
$A(r)$ ${\ displaystyle A (r)}$ $A (r)$ : amplitudine luminoasă (PSF) în planul imaginii
$I(r)=|A(r)|^{2}$ ${\ displaystyle I (r) = | A (r) | ^ {2}}$ ${\ displaystyle I (r) = | A (r) | ^ {2}}$ : intensitatea luminii imaginii
$d_{[3dB]}={\frac {0.51\,\lambda }{NA}}$ ${\ displaystyle d _ {[3dB]} = {\ frac {0.51 \, \ lambda} {NA}}}$ ${\ displaystyle d _ {[3dB]} = {\ frac {0.51 \, \ lambda} {NA}}}$ : lățimea la jumătatea înălțimii vârfului central al $I(r)$ ${\ displaystyle I (r)}$ ${\ displaystyle I (r)}$ , numit și FWHM din acronimul în limba engleză " Full Width at Half Maximum ", identifică distanța de la punctul maxim la care intensitatea este redusă la jumătate și amplitudinea se reduce cu un factor ${\sqrt {2}}$ ${\ displaystyle {\ sqrt {2}}}$ ${\ sqrt {2}}$ (-3 dB); această valoare este identificată și ca rezoluție punctuală a sistemului.
$d={\frac {0.61\,\lambda }{NA}}$ ${\ displaystyle d = {\ frac {0.61 \, \ lambda} {NA}}}$ ${\ displaystyle d = {\ frac {0.61 \, \ lambda} {NA}}}$ : rezoluția laterală a microscopului conform criteriului Rayleigh .

În ipoteza paraxialității și a opticii perfecte, se poate arăta ^[5] că microscopul confocal ideal, adică cel cu găuri infinitezimale, are un PSF $A_{c}(r)=A(r)^{2}$ ${\ displaystyle A_ {c} (r) = A (r) ^ {2}}$ ${\ displaystyle A_ {c} (r) = A (r) ^ {2}}$ , care este pătratul valabil pentru un microscop tradițional.

Aceasta înseamnă că un microscop confocal poate oferi o imagine mai bine definită a obiectelor punctuale, a muchiilor și a detaliilor în general.

Comparația răspunsurilor pasului unui microscop confocal și a unui microscop standard.

Același lucru se poate spune și pentru distribuția intensității $I_{c}(r)$ ${\ displaystyle I_ {c} (r)}$ ${\ displaystyle I_ {c} (r)}$ : figura arată cum ambele tipuri de microscop sunt capabile să răspundă la același interval de frecvențe spațiale; diferența constă în rapiditatea cu care scade răspunsul, rezultând un contrast mai mare pentru sistemul confocal.

În ceea ce privește microscopul standard, rezoluția punctului este definită $d_{c}$ ${\ displaystyle d_ {c}}$ ${\ displaystyle d_ {c}}$ , care corespunde FWHM din $I_{c}$ ${\ displaystyle I_ {c}}$ $IC$ :

$d_{c[3dB]}={\frac {0.37\,\lambda }{NA}}$ ${\ displaystyle d_ {c [3dB]} = {\ frac {0.37 \, \ lambda} {NA}}}$ ${\ displaystyle d_ {c [3dB]} = {\ frac {0.37 \, \ lambda} {NA}}}$

care este cu aproximativ 27% mai mică decât cea a microscopului tradițional.

Totuși, acest parametru, așa cum s-a anticipat, nu înseamnă o rezoluție transversală mai bună pentru abordarea confocală, ci o mai bună confinare a spotului, adică un contrast mai bun.

Acest lucru justifică posibilitatea imaginii cu lumină coerentă în absența petelor ; de fapt lobii laterali ai discului Airy suferă o atenuare de 26 dB în raport cu vârful central, comparativ cu 18 dB ai microscopului standard ^[5] .

Deoarece pata este generată de suma lobilor laterali ai multor puncte învecinate, efectul devine aproape imperceptibil în cazul confocal.

Criteriul lui Rayleigh definește rezoluția laterală a sistemului confocal ideal, atunci când aceasta este limitată doar de difracție

$d_{c}={\frac {0.56\,\lambda }{NA}}$ ${\ displaystyle d_ {c} = {\ frac {0.56 \, \ lambda} {NA}}}$ ${\ displaystyle d_ {c} = {\ frac {0.56 \, \ lambda} {NA}}}$

care este cu 8% mai puțin decât cel al microscopului tradițional.

Rezoluție confocală axială

Pentru a calcula amploarea contribuției difractive la rezoluția axială a unui sistem confocal, se face trimitere la teoria scalară pentru punctul reflector ^[5] .

Se presupune că obiectivul, ipotetic lipsit de aberații, este iluminat cu un fascicul de colimat.

Prin unele calcule, se obține extensia axială a figurii de difracție deasupra și dedesubtul planului de imagine confocal, înțeles ca FWHM al $I_{c}(z)$ ${\ displaystyle I_ {c} (z)}$ ${\ displaystyle I_ {c} (z)}$ :

$d_{cZ[3dB]}={\frac {0.62\,\lambda }{n(1-\cos {\alpha })}}\simeq {\frac {1.24\,\lambda n}{NA^{2}}}$ ${\ displaystyle d_ {cZ [3dB]} = {\ frac {0.62 \, \ lambda} {n (1- \ cos {\ alpha})}} \ simeq {\ frac {1.24 \, \ lambda n} {NA ^ {2}}}}$ ${\ displaystyle d_ {cZ [3dB]} = {\ frac {0.62 \, \ lambda} {n (1- \ cos {\ alpha})}} \ simeq {\ frac {1.24 \, \ lambda n} {NA ^ {2}}}}$

NB. Dezvoltarea lui Taylor de $\cos {\alpha }$ ${\ displaystyle \ cos {\ alpha}}$ ${\ displaystyle \ cos {\ alpha}}$ în jurul valorii de zero este $\cos {\alpha }\simeq 1-{\frac {\alpha ^{2}}{2}}+...$ ${\ displaystyle \ cos {\ alpha} \ simeq 1 - {\ frac {\ alpha ^ {2}} {2}} + ...}$ ${\ displaystyle \ cos {\ alpha} \ simeq 1 - {\ frac {\ alpha ^ {2}} {2}} + ...}$

Aplicând la $I_{c}(z)$ ${\ displaystyle I_ {c} (z)}$ ${\ displaystyle I_ {c} (z)}$ Criteriul lui Rayleigh, pe de altă parte, obține rezoluția axială efectivă a sistemului confocal cu un orificiu infinitezimal doar în prezența difracției:

$d_{cz}={\frac {0.89\,\lambda }{n(1-\cos {\alpha })}}\simeq {\frac {1.78\,\lambda n}{NA^{2}}}$ ${\ displaystyle d_ {cz} = {\ frac {0.89 \, \ lambda} {n (1- \ cos {\ alpha})}} \ simeq {\ frac {1.78 \, \ lambda n} {NA ^ {2 }}}}$ ${\ displaystyle d_ {cz} = {\ frac {0.89 \, \ lambda} {n (1- \ cos {\ alpha})}} \ simeq {\ frac {1.78 \, \ lambda n} {NA ^ {2 }}}}$

care este cu 11% mai mică decât cea a microscopului standard.

În cele din urmă, cu utilizarea configurației confocale, se observă o creștere teoretică a performanței, datorită reducerii contribuției difractive și a creșterii contrastului.

Rețineți că aproximările făcute sunt suficient de precise doar pentru $NA<0.5$ ${\ displaystyle NA <0,5}$ ${\ displaystyle NA <0,5}$ .

De asemenea, trebuie avut în vedere faptul că toate analizele prezentate aici evidențiază doar aspectele legate de difracție și, în ceea ce privește realitatea faptelor, rezultatele obținute reprezintă doar estimări optimiste. De fapt, se poate demonstra experimental că aberațiile inevitabile introduse de lentile lărgesc vârful central al PSF calculat, modifică înălțimea lobilor laterali și le modifică simetria.

Structură și tehnologii

Surse

Rolul sursei este de a oferi o lumină suficient de stabilă și de strălucitoare pentru a permite colectarea unui semnal util în ciuda prezenței orificiilor. Utilizarea unei surse inconsistente permite realizarea de imagini color, dar necesită utilizarea unor sisteme optice scumpe și corecte pentru lungimi de undă multiple. Mai mult, este necesar un sistem de colectare a luminii care, în general, pentru acest tip de sursă, este emis în toate direcțiile. Lumina incoerentă este deosebit de utilă pentru observarea exemplarelor cu structuri geometrice periodice. De fapt, atunci când sunt iluminate cu lumină coerentă, modifică imaginea datorită interferenței dintre straturile reflectorizante succesive ^[5] .

Sursa LASER coerentă este deosebit de atractivă, deoarece oferă lumină extrem de strălucitoare, monocromatică și colimată la un preț redus. Monocromaticitatea simplifică proiectarea obiectivelor și a filtrelor, reducând în continuare costurile, iar colectarea de imagini color rămâne posibilă cu utilizarea mai multor LASER-uri, formând un sistem RGB .

În cazul LASER-ului cu modul TEM ₀₀ la ieșire, utilizarea orificiului de iluminare devine superfluă, deoarece lumina apare sistemului ca și cum ar proveni dintr-o sursă punctuală plasată la infinit (luați în considerare un LASER cu posibilă lentilă colimantă la ieșire). În acest caz, este suficient să luați în considerare diametrul de ieșire al sursei fasciculului emis ca și cum ar fi diametrul orificiului și reglați distanța focală a colectorului pentru a obține raportul de reducere corect pe planul obiectului (a se vedea figura). Dacă, pe de altă parte, fasciculul este imperfect sau multimodal, acesta poate fi „curățat” prin focalizarea acestuia printr-un orificiu cu un diametru mai mic decât cel al primului minim al discului Airy care se formează în focar (vezi figura).

În general, intensitatea și direcția extrem de stabilă sunt necesare de la o sursă LASER, sub sancțiunea veridicității datelor colectate. Stabilitatea lungimii de undă de emisie, pe de altă parte, nu este un factor critic ^[5] .

Se pare că iluminarea coerentă ar trebui să aducă pe imagine pata caracteristică a LASERULUI , dar așa cum am văzut (a se vedea „Rezoluția confocală laterală”), datorită configurației confocale acest lucru nu se întâmplă, deoarece doar o regiune foarte mică a eșantionului este iluminat la un moment dat, reducând diferența de cale optică între undele coerente.

Sisteme de scanare

Pentru a putea construi o imagine bidimensională, punctul de iluminare care lovește proba trebuie deplasat în plan $X y$ ${\ displaystyle xy}$ $X y$ , realizând o scanare extrem de precisă și cât mai rapidă posibil.

Microscoapele confocale sunt în general clasificate în funcție de sistemul de scanare adoptat:

scanare pe scenă , mișcarea eșantionului;
scanare cu un singur fascicul, mișcarea unui singur fascicul de iluminare;
scanare cu raze multiple , generare de raze de iluminare multiple.

Scanare eșantion

Abordarea de scanare pe etape este cea mai simplă din punct de vedere conceptual: întreaga cale optică este fixă și eșantionul este făcut să se traducă (vibreze) cu precizie, deplasându-se continuu față de punctul de lumină. În acest fel, iluminarea și imaginile confocale se află exact pe axa optică, simplificând designul opticii, care nu trebuie corectate pentru deschideri mari. În general, rata de cadru realizabilă cu această tehnică este de aproximativ 0,1 Hz ^[1] .

Pe de altă parte, mutarea probei cu precizie este problematică, deoarece mediul fluid în care sunt scufundate majoritatea structurilor biologice de interes nu asigură stabilitatea acesteia în timpul mișcării. În plus, mișcarea fizică a unui obiect durează mult și, prin urmare, constrânge scanarea unor rate incompatibile cu imagistica în timp real.

Scanare cu un singur fascicul

În configurația de scanare cu un singur fascicul , fasciculul de iluminare se deplasează pe probă într-un mod controlat. Devierea fasciculului poate apărea datorită utilizării diferitelor dispozitive, fiecare cu avantajele și dezavantajele sale.

Deflector acustic-optic

Principiul de funcționare al deflectorului acustic-optic.

Numit și AOD ( Acousto-Optic Deflector ), este alcătuit dintr-un cristal fotoelastic (un material fotoelastic prezintă birefringență atunci când este supus unei tensiuni mecanice) care este solicitat de un traductor piezoelectric și traversat de o undă acustică cu frecvență reglabilă. Prin urmare, comportamentul birefringent al mediului poate fi modulat și este posibil să se impună unghiul de deviere al fasciculului de lumină care trece prin el ^[6] .

Aceste dispozitive în stare solidă beneficiază de faptul că au foarte puține piese în mișcare și o inerție neglijabilă, permițând scanări ale dinților de ferăstrău cu timpi de recuperare neglijabili și frecvențe ultra-ridicate (până la 100 kHz). Din păcate, bazându-se pe proprietățile dispersive ale materialului fotoactiv, AOD constrânge utilizarea luminii monocromatice și permit unghiuri de deviere limitate. Un alt aspect de luat în considerare este deschiderea dreptunghiulară a cristalului, care trebuie cuplată la fasciculul LASER prin lentile cilindrice ^[7] .

Oglindă galvanometrică

Oglindă galvanometrică modernă de la Scanlab.

Este o oglindă conectată la un galvanometru de înaltă precizie și acționată în curent cu un semnal de control din dinte de ferăstrău. Pentru scanarea probei în ambele direcții sunt necesare două dispozitive amplasate ortogonal $X y$ ${\ displaystyle xy}$ $X y$ : una mută rapid punctul confocal de-a lungul axei orizontale (axa rapidă ) în timp ce cealaltă scanează încet de-a lungul axei verticale ( axa lentă ).

Oglinzile galvanometrice oferă suprafețe reflectorizante mari și pilotaj simplu, în detrimentul vitezei de scanare. Fiind construit în mod similar cu motoarele electrice, folosind un rotor și un stator, inerția unui sistem astfel conceput nu permite accelerații prea mari, altfel se va supraîncălzi și se va sparge ^[7] . De obicei, aceste oglinzi acordă frecvențe de scanare liniare care nu depășesc 1000 Hz.

Oglindă rezonantă

Este o oglindă realizată cu tehnologia MEMS , care încorporează atât dispozitivul de acționare, cât și dispozitivul electronic de comandă ^[8] . Acest dispozitiv utilizează același principiu de bază al galvanometrului, dar atinge frecvențe de scanare mult mai mari (4-8 kHz) datorită diferitelor tehnici de acționare: curentul de comandă (acționare magnetică) sau tensiunea de comandă (acționare electrostatică) au o sinusoidală și sunt folosit pentru stabilirea unei oscilații armonice. Semnalul pilot este sincronizat cu perioada de oscilație a oglinzii, care poate astfel „rezona” la frecvențe de ordinul câtorva kHz. Cu ajutorul unor piese mecanice mai complexe, dispozitivul poate fi înclinat ( înclinat ) aproximativ două axele perpendiculare, rezonând rapid într-o direcție și măturându-se încet de-a lungul celeilalte, într-un mod similar cu o oglindă galvanometrică.

Principalele dezavantaje ale acestei abordări sunt zona mică oferită de oglinzile MEMS și unghiul de înclinare neliniar în funcție de timp ^[7] .

Indiferent de mediul utilizat pentru scanare, sistemul optic trebuie corectat pentru aberații în afara axei și pentru a minimiza curbura câmpului. În plus, pe lângă mecanismul de scanare, microscopii cu scanare cu un singur fascicul folosesc lentile suplimentare pentru a imagina focalizarea scanerului pe planul focal posterior al obiectivului, rezultând un sistem telecentric , adică a cărui putere de mărire nu depinde de punctul Concentrați-vă.

Un microscop confocal cu scanare cu un singur fascicul care utilizează o sursă LASER este denumit în mod obișnuit CLSM ( microscop confocal cu scanare laser ).

Scanare cu fascicul multiplu

În ceea ce privește configurația de scanare cu fascicule multiple , ideea de bază este de a optimiza timpii de scanare prin exploatarea prezenței simultane a mai multor puncte iluminate. A face acest lucru fără a compromite confocalitatea sistemului este posibil doar prin studierea unui model de iluminare adecvat, cum ar fi menținerea unei anumite distanțe între grinzi și astfel limitarea luminii interdifuse.

Principalele tehnici adoptate sunt două:

Disc Nipkow

Diagrama unui disc Nipkow

Este un disc rotativ care conține o matrice de orificii dispuse în spirală. Sursa plasată în spatele discului luminează obiectul selectiv, prin mai multe fascicule care scanează întregul plan al obiectului în timpul unei rotații.

Din păcate, cea mai mare parte a luminii atinge zonele opace ale discului, se pierde inutil și se poate împrăștia în calea de formare a imaginii, reducând drastic contrastul. O soluție la această problemă constă în suprapunerea pe discul Nipkow a unui al doilea disc care conține o matrice de microlente, capabile să colecteze mai multă lumină și să o concentreze pe orificiile relative (varianta Yokogawa).

Dispozitiv digital Micromirror

Diagrama componentelor unui DMD.

De asemenea, cunoscut sub denumirea de DMD , „Dispozitivul de micro-oglinzi digitale” este o matrice de oglinzi pătrate micrometrice, care pot fi acționate independent în mod digital. Fiecare oglindă poate presupune două înclinații diferite pe baza semnalului digital de comandă, direcționând lumina incidentă de-a lungul unei zone bine definite. Trecerea între configurații este foarte rapidă, făcând acest dispozitiv o soluție excelentă pentru imagini în timp real.

Pe de altă parte, DMD-urile sunt grav penalizate atunci când vine vorba de eficiență: lumina care vine de la sursă trebuie să ilumineze întreaga matrice, dar doar o cantitate mică la un moment dat este de fapt direcționată către eșantion. De asemenea, trebuie luat în considerare faptul că o altă fracțiune de lumină se pierde în spații, deși înguste, prezente între micro-oglinzile adiacente. Mai mult, dimensiunile foarte mici ale oglinzilor fac ca matricea să fie o rețea de difracție bidimensională reală, cu problemele evidente legate de uniformitatea câmpului iluminat.

Oricare ar fi metoda de scanare utilizată, este ușor de văzut că există un fel de principiu de incertitudine: nu este posibil să se obțină simultan o rezoluție temporală ridicată (frecvență mare de scanare) și o rezoluție spațială ridicată (punct confocal mic), fără a reduce dimensiunea câmpului obiectului, adică numărul de pixeli din imaginea finală. Mărirea orificiului sau creșterea numărului său crește luminozitatea și, prin urmare, viteza de scanare, dar compromite puterea de rezoluție; dimpotrivă, un orificiu foarte îngust optimizează calitatea imaginii colectate, dar limitează timpii lungi de scanare, datorită luminii reduse care ajunge la detector.

Există microscopuri confocale care utilizează o fantă în loc de o gaură, scanând eșantionul de-a lungul unei singure direcții ( scanare în fante ): rezultatul este o simplificare a proiectului și o îmbunătățire semnificativă a cadrelor. Din păcate, rezoluția este afectată de-a lungul unei direcții, dar suprimarea luminii difuzate de planurile nefocalizate rămâne ridicată ^[1] ^[5] .

Detectoare

După cum sa menționat deja, într-un microscop confocal, lumina colectată de sistemul optic este focalizată prin orificiul de detectare, reducând drastic cantitatea de lumină disponibilă pentru formarea imaginii; prin urmare, este necesar să se utilizeze detectoare foarte sensibile, capabile să răspundă rapid la un flux de lumină de intensitate variabilă.

Discriminarea spațială nu este în general o caracteristică necesară, deoarece imaginea colectată este punctuală, iar zona de detectare sensibilă nu este un parametru critic. Acest lucru nu este adevărat în cazurile de scanare cu fascicule multiple și scanare cu fante, în care se utilizează un senzor CCD bidimensional și, respectiv, liniar.

De departe cele mai utilizate tipuri de detectoare sunt două: tubul fotomultiplicator (PMT, PhotoMultiplier Tube ) și fotodioda avalanșă (APD, Avalanche PhotoDiode ).

PMT, cu eficiență cuantică scăzută, dar câștig foarte mare și răspuns rapid, poate funcționa în regim de numărare a fotonilor și are un raport semnal-zgomot ridicat. Cu toate acestea, dimensiunea, costul și tensiunile ridicate de alimentare pot fi o problemă.

APD este un dispozitiv compact, stabil și relativ ieftin; prezintă o eficiență cuantică ridicată și un răspuns rapid, cu o amplificare internă de aproximativ 50-100. O astfel de fotodiodă funcționează la tensiuni de 100-300 V, mult mai mici decât cele necesare pentru un tub fotomultiplicator, dar pe de altă parte oferă raporturi semnal-zgomot mult mai mari.

Notă

^ ^a ^b ^c Pawley JB (editor), Handbook of Biological Confocal Microscopy , ed. a 3-a, Berlin, Springer, 2006, ISBN 0-387-25921-X .
^ White, JG, 1987. Microscop de scanare confocală - Cerere de brevet din Marea Britanie GB 2 184 321 A (depusă la 15 decembrie 1986).
^ Marvin Minsky. „Memorie despre inventarea microscopului de scanare confocală”. În: Scanarea 10 (2000), pp. 128–138.
^ Marvin Minsky. Aparate de microscopie . Brevetul SUA nr. 3013467. Decembrie 1957.
^ ^a ^b ^c ^d ^e ^f Timothy R. Corle și Gordon S. Kino, Microscopie optică de scanare confocală și sisteme de imagini conexe , Academic Press, 1996.
^ IC Chang, „Dispozitive și aplicații acusto-optice”. În: Manual de optică: dispozitive, măsurători și proprietăți. A 2-a ed. Vol. 2, pp. 12.1-12.54. , McGrawHill, 1995.
^ ^a ^b ^c Jeffrey M. Larson, Stanley A. Schwartz și Michael W. Davidson, Rezonant Scanning in Laser Confocal Microscopy , la microscopyu.com .
^ Hamamatsu Photonics KK, HPK MEMS Mirrors ( PDF ), la hamamatsu.com .

Alte proiecte

Wikimedia Commons conține imagini sau alte fișiere despre microscopul confocal

linkuri externe

Microscopie confocală cu scanare laser (PDF)

( EN ) Microscop confocal , pe Encyclopedia Britannica , Encyclopædia Britannica, Inc.

Controllo di autorità	LCCN ( EN ) sh90001543

Portale Ingegneria

Portale Medicina

[Pawley_2006-1] Pawley JB (editor), Handbook of Biological Confocal Microscopy , ed. a 3-a, Berlin, Springer, 2006, ISBN 0-387-25921-X .

[2] White, JG, 1987. Microscop de scanare confocală - Cerere de brevet din Marea Britanie GB 2 184 321 A (depusă la 15 decembrie 1986).

[3] Marvin Minsky. „Memorie despre inventarea microscopului de scanare confocală”. În: Scanarea 10 (2000), pp. 128–138.

[4] Marvin Minsky. Aparate de microscopie . Brevetul SUA nr. 3013467. Decembrie 1957.

[:0-5] ^ ^a ^b ^c ^d ^e ^f Timothy R. Corle și Gordon S. Kino, Microscopie optică de scanare confocală și sisteme de imagini conexe , Academic Press, 1996.

[6] IC Chang, „Dispozitive și aplicații acusto-optice”. În: Manual de optică: dispozitive, măsurători și proprietăți. A 2-a ed. Vol. 2, pp. 12.1-12.54. , McGrawHill, 1995.

[:1-7] Jeffrey M. Larson, Stanley A. Schwartz și Michael W. Davidson, Rezonant Scanning in Laser Confocal Microscopy , la microscopyu.com .

[8] Hamamatsu Photonics KK, HPK MEMS Mirrors ( PDF ), la hamamatsu.com .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]