ELISA (biochimie)
Această intrare sau secțiune pe tema procedurilor de diagnostic nu citează sursele necesare sau cei prezenți sunt insuficienți . |
ELISA este un acronim derivat din expresia test enzimatic imunosorbent englezesc ( test imuno-absorbant legat de o enzimă). Este o metodă de imunoanaliză versatilă utilizată în biochimie pentru a detecta prezența unei substanțe folosind unul sau mai mulți anticorpi la care unul este legat de o enzimă : această metodă de investigație se încadrează în categoria imunoanalizelor enzimatice . Substanța care trebuie detectată poate fi un antigen aparținând unui agent patogen sau unei molecule mai mici, numită hapten , ca de exemplu pentru a recunoaște prezența steroizilor . Dacă în locul unei enzime, se utilizează un radionuclid (adesea iod-125 ) pentru a detecta pozitivitatea testului, se numește RIA (din testul radio-imuno în engleză).
Testul ELISA este, de asemenea, utilizat pe scară largă pentru a stabili prezența anticorpilor împotriva unui anumit antigen în plasma sanguină a pacientului pentru a stabili dacă a existat expunere la un anumit agent patogen. Acest lucru se face în testul HIV pentru a stabili dacă sistemul imunitar al persoanei a fost confruntat cu virusul SIDA .
Există mai multe variante ale testului ELISA, care diferă în funcție de componenta care urmează să fie detectată. În testul direct prezența antigenului este determinată, în testul indirect, prezența anticorpilor împotriva antigenului. Eseul poate fi competitiv sau necompetitiv . ELISA direct necompetitiv se realizează în conformitate cu diferite metode: ELISA simplă și sandwich.
În metoda simplă, antigenul este absorbit pe placă și detectat cu un anticorp marcat cu enzimă. În metoda sandwich anticorpul care este utilizat pentru captarea antigenului este absorbit pe placă, anticorpii absorbiți sunt expuși apoi la fluidul care poate conține antigenul și se adaugă un al doilea anticorp marcat pentru a detecta că antigenul a fost capturat. În acest al doilea caz, epitopii HP2 de pe antigenul celor doi anticorpi trebuie să fie complet diferiți fără nici o suprapunere (vezi figura).
Metoda indirectă (varianta sandwich)
Metoda implică acoperirea fundului puțului cu un anticorp specific antigenului pe care dorim să îl măsurăm. Se efectuează o spălare. Se introduce apoi antigenul, care se va lega de anticorp. Se spală în continuare pentru a îndepărta excesul sau antigenele nelegate. Se introduce un anticorp specific care va lega complexul anticorp + antigen, formând un „al treilea” strat (sau „sandviș”), din care testul își ia numele. O enzimă specifică este atașată la ultimul anticorp pe care l-am adăugat și adăugarea substratului său va forma un produs colorat, care va evidenția fântâna dacă este prezent antigenul de interes.
Fazele rezumative includ:
- Inserarea unei soluții de anticorp primar, specifică antigenului care trebuie căutat și identificat în ser sau într-un lichid biologic dat, în godeurile unei plăci speciale de testat în polistiren. Fundul godeului este saturat cu anticorpul aderat la fundul godeurilor și excesul este spălat.
- Adăugarea, în soluții cu concentrații diferite necunoscute, a probelor din care este necesar să se testeze prezența sau nu a antigenului caracteristic al organismului patogen și spălarea cu soluție tampon; antigenul, dacă este prezent, se leagă specific de anticorp și excesul este spălat.
- Adăugarea anticorpului secundar, care poate fi reprezentat de un anticorp anti- imunoglobulină uman, care poate fi obținut de la animale mari prin inocularea lor cu ser uman (ale cărui proteine sunt recunoscute ca antigeni străini de sistemul imunitar al animalului și, prin urmare, determină formarea anticorpi). Acest anticorp este conjugat cu o enzimă, de obicei peroxidază sau fosfatază alcalină, și spălat cu o soluție tampon; Anticorpul secundar se leagă selectiv de antigen, dacă este prezent, iar excesul este spălat. Absența antigenului specific pentru anticorp înseamnă că anticorpul secundar (și enzima aferentă conjugată cu acesta), cu spălare, este spălat.
- Dacă enzima utilizată este fosfataza alcalină, se adaugă fosfat de p-nitrofenil ca substrat; Această substanță provoacă o reacție cu fosfataza alcalină conjugată cu anticorpul secundar producând p-nitrofenol de culoare galbenă. Dacă antigenul caracteristic organismului patogen este absent în puț, nu va exista nici măcar enzima conjugată cu anticorpul secundar și, prin urmare, reacția nu va avea loc.
- Adăugarea de hidroxid de sodiu pentru a bloca reacția dintre enzima fosfatază și fosfatul de p-nitrofenil;
- Citirea rezultatului, exprimarea reacției dintre enzima fosfatază și p-nitrofenilfosfat care produce o reacție cromogenă sau fluorogenă pe substrat - sau dezvoltarea luminii de culoare sau fluorescență - măsurabile ulterior printr-un spectrofotometru .
Dezvoltarea culorii este indicativă a prezenței antigenului de testat, iar intensitatea culorii, măsurabilă grație spectrofotometrului, este semicantitativă în funcție de o scară arbitrară de intensitate.
Pentru a valida testul, operațiile de mai sus sunt efectuate în două godeuri distincte care diferă în ceea ce privește tipul de anticorp primar care este introdus inițial: un godeu este umplut cu anticorpul specific pentru antigenul care trebuie identificat, în timp ce celălalt este saturat cu un anticorp nespecific. Pentru ca testul să fie considerat valid, trebuie mai întâi să fie negativ în acest ultim puț și dacă proba biologică testată conține într-adevăr antigenul de interes, testul trebuie să fie pozitiv în celălalt puț, cel saturat cu anticorpul primar specific .
Există, de asemenea, un alt tip de metodă indirectă în care antigenii sunt atașați la fundul puțului de care se leagă în mod specific un anticorp (anticorp primar). Acesta este apoi adăugat la godeu și, după spălare, se adaugă un alt anticorp (anticorp secundar) îndreptat împotriva fragmentului cristalizabil ( Fc, lanț greu) al anticorpului primar. Cei doi anticorpi sunt produși la specii diferite, primul de exemplu poate fi produs la șoareci și al doilea la un alt animal, cum ar fi capra. În mod normal, anticorpul secundar este proiectat astfel încât să fie conjugat cu un marker precum fosfataza alcalină (AP) sau peroxidaza (HRP) care produc produse colorate specifice din substraturi, astfel încât metoda de detectare este similară cu ceea ce s-a spus mai sus. Singura diferență este că nu există anticorpi în partea de jos a puțului, ci antigenul de interes. Această abordare este destul de similară cu cea adoptată pentru detectarea benzilor de proteine pe foi de nitroceluloză sau polivinilfenorură (PVDF) în faza finală a dezvoltării Western blot .
Testul ELISA NON COMPETITIV este un test calitativ și semicantitativ: nu oferă o valoare reală, dar afirmă prezența sau absența analitului. Testul ELISA COMPETITIV este în schimb un test calitativ-cantitativ: oferă o valoare specifică cu o abatere standard .
Metoda directă
În metoda directă, fundul puțului este acoperit mai întâi cu extractul proteic în care ar putea fi prezentă proteina pe care dorim să o măsurăm (antigenul). Excesul este spălat pentru a scăpa de nedorit. Antigenul este adăugat la antigenul care a fost probabil adsorbit în fundul puțului. Acest anticorp este conjugat cu o etichetă enzimatică, de obicei fosfatază alcalină (AP) sau peroxidază (HRP: hrean peroxidază , hrean peroxidază). Spală excesul încă o dată. Se efectuează o spălare pentru a elimina orice anticorp care nu este legat de antigen (cei combinați rezistă în schimb la spălare). În cele din urmă, se adaugă substratul enzimei cu care a fost marcat anticorpul: o schimbare de culoare indică prezența antigenilor în probă, deoarece enzima utilizată acționează asupra substratului modificându-l, astfel încât să absoarbă lumina și rezultatele colorate. [1] Arhivat la 15 martie 2012 la Internet Archive .
Scopul său este de a căuta antigeni specifici într-un lichid biologic dat, având la dispoziție anticorpi marcați la care se pot lega sau, dimpotrivă, căutarea anticorpilor specifici care au anticorpi marcați disponibili , care se pot lega de fragmentul cristalizabil (Fc) al din urmă.
Dacă are succes, Western Blot este efectuat pentru confirmare.
Inovații
Multiple & Portable ELISA (M&P ELISA) (brevetul US 7510687 de A. Mazzeo & G. Petracca) utilizează o conformație inovatoare a fazei solide: o tijă din polistiren din care ies 8 sau 12 ogive. Întreaga tijă trebuie introdusă direct în eșantionul de testat și toate etapele ulterioare (spălare, incubație în conjugat și incubare în cromogen) se efectuează pur și simplu prin scufundarea ogivilor tijei - extrasă din eșantion după incubare adecvată - în puțuri de microplăci sau benzi standard, preumplute cu soluții și reactivi. Avantajele importante sunt:
- tija introdusă în probă are vârfurile sensibilizate cu reactivi diferiți, astfel încât în fiecare probă este posibil să se caute simultan diferiți anticorpi și / sau antigeni diferiți, analize multiple sau multi-screening;
- volumul probei analizate poate fi mărit pentru a crește sensibilitatea testului în probele clinice (sânge, salivă, urină), alimentare (lapte în vrac, bazin de ouă) și de mediu (probe de apă);
- o bucată din fiecare tijă nu este sensibilizată și acționează ca un control negativ, pentru a evalua specificitatea tuturor testelor de detectare a anticorpilor și / sau antigenului efectuate în eșantionul examinat;
- distribuția probelor, conjugaților și cromogenului în puțurile microplăcilor sau microstripilor nu trebuie efectuată; spălările sunt extrem de simplificate;
- tehnologia inovatoare permite crearea de kituri de laborator gata de utilizat și kituri portabile pentru analize de teren (clinici, aeroporturi, vamă, ferme).
Notă
- ^ Stura, EA, Muller, BH, Michel, S., Jolivet-Reynaud, C., Ducancel, F., Structura cristalină a antigenului specific prostatei umane (PSA) într-un complex de anticorpi sandwich. , în J. Mol. Biol. , vol. 414, nr. 5, 9 decembrie 2011, pp. 530-544, DOI : 10.1016 / j.jmb.2011.10.007 , PMID 22037582 .
Elemente conexe
Alte proiecte
-
Wikimedia Commons conține imagini sau alte fișiere despre ELISA
linkuri externe
- ( EN ) ELISA , în Encyclopedia Britannica , Encyclopædia Britannica, Inc.
| Controlul autorității | LCCN (EN) sh85044227 · GND (DE) 4152476-7 |
|---|
