Western blot

De la Wikipedia, enciclopedia liberă.
Salt la navigare Salt la căutare
Western blot folosind un anticorp care detectează proteinele modificate cu acid lipoic

Western blot sau imunoblot este o tehnică biochimică care permite identificarea unei proteine specifice într-un amestec de proteine, prin recunoașterea de către anticorpi specifici; în general, pentru a facilita recunoașterea, amestecul de proteine ​​este mai întâi separat în funcție de dimensiunea (sau greutatea moleculară ) a acestora folosind un gel de poliacrilamidă (dar există variații precum punct blot sau slot blot, în care amestecul de proteine ​​nu este separat în funcție de dimensiune, dar ne bazăm pe selectivitatea antigen / anticorp); ulterior proteinele sunt transferate pe un suport, care este de obicei o membrană de nitroceluloză , iar apoi recunoașterea efectivă a proteinei se realizează prin utilizarea unui anticorp specific.

Recent, au fost dezvoltate tehnici care permit recunoașterea antigenului / anticorpului direct în matricea gelului, evitând astfel transferul de membrană. Această tehnică este utilizată atunci când eșantionul corsic este compus dintr-un amestec de multe proteine, astfel încât, cu o culoare standard ( albastru Coomassie sau azotat de argint ), nu ar fi posibil să le deosebim una de cealaltă sau când, în ciuda faptului că sunt bine distincte ( discrete ), proteina de interes este prea mică pentru a fi vizualizată cu alte tehnici. De fapt, vestul are trei pași în care are loc amplificarea semnalului, ceea ce face vizibile chiar și zecimi de picomol (10 −12 mol) de proteină. [1] [2] [3]

Istorie

Metoda a fost concepută de George Stark la Universitatea Stanford . Numele Western blot a fost dat de tehnica lui W. Neal Burnette , [4] este o piesă pe numele Southern blot , o tehnică de detectare a ADN dezvoltată anterior de Edwin Southern . Detectarea ARN-ului se numește Northern blot . Există multe companii speciale de reactivi pentru anticorpi ( monoclonali și policlonali ) împotriva a zeci de mii de proteine ​​diferite. [3] Anticorpii comerciali pot fi costisitori, anticorpii nelegați pot fi reutilizați. Această metodă este utilizată în biologia moleculară , biochimie , imunogenetică și alte discipline.

Pași într-un western blot

Pregătirea țesăturii

Probele pot fi prelevate din țesuturi întregi sau din culturi de celule. Țesuturile solide sunt mai întâi zdrobite mecanic cu amestecătoare (volume mari) sau folosind omogenizatoare (volume mici) sau cu sonicare . Celulele pot fi, de asemenea, deschise prin astfel de metode. Virușii sau probele prelevate din medii pot fi surse de proteine ​​și, prin urmare, western blot nu este utilizat doar în studiile celulare. Detergenții, sărurile și tampoanele pot fi utilizate pentru a crește liza celulară și a solubiliza proteinele. Inhibitorii de protează și fosfatază sunt adesea adăugați pentru a preveni digestia probelor de către propriile enzime . Pregătirea țesăturii se face adesea la temperaturi scăzute pentru a evita degradarea. O combinație de tehnici biochimice și mecanice - inclusiv diferite tipuri de filtrare și centrifugare - poate fi utilizată pentru a separa diferite celule și organite .

SDS-PAGE sample.png

Electroforeză cu gel

Pictogramă lupă mgx2.svg Același subiect în detaliu: electroforeza pe gel .

Proteinele probe sunt separate folosind electroforeza pe gel. Separarea proteinelor poate avea loc prin punct izoelectric (pI), greutate moleculară , sarcină electrică sau o combinație a acestor factori. Natura separării depinde de manipularea probei și de natura gelului. Acest mod este cel mai utilizat pentru a identifica o proteină. Cel mai frecvent tip de electroforeză pe gel folosește geluri de poliacrilamidă ( electroforeză pe gel de poliacrilamidă ) și tampoane încărcate cu laurilsulfat de sodiu (SDS). SDS-PAGE (electroforeza pe gel de poliacrilamidă SDS) menține polipeptidele într-o stare denaturată atunci când sunt tratate cu agenți reductori puternici pentru a elimina structurile secundare și terțiare (de exemplu, grupările disulfură [SS] și mercaptan [SH și SH]) și permit separarea proteinelor pe baza greutatea lor moleculară . Proteinele prelevate leagă SDS-ul, ceea ce le conferă o sarcină negativă și se deplasează astfel către electrodul pozitiv prin plasă de gel. Proteinele mai mici migrează mai repede prin această plasă, iar proteinele sunt separate de mărime (măsurată în kiloDalton , kDa). Concentrația de acrilamidă determină rezoluția gelului - cu cât este mai mare concentrația, cu atât rezoluția proteinelor cu greutate moleculară mică este mai bună. Proteinele se deplasează într-o singură dimensiune de-a lungul gelului pentru mai multe pete. Probele sunt încărcate în godeuri din gel. O bandă este de obicei rezervată pentru un marker sau o scală , un amestec comercial de proteine ​​cu greutate moleculară definită, de obicei colorate pentru a forma benzi colorate vizibile. Când se aplică tensiune electrică de -a lungul gelului, proteinele migrează prin el la viteze diferite, în funcție de mărimea lor. Aceste viteze diferite de avansare ( mobilitate electroforetică ) permit separarea în benzi în fiecare bandă .

SDS-PAGE Electrophoresis.png

Poate fi utilizată și electroforeza bidimensională .

Transfer

Pentru a face proteinele accesibile pentru detectarea anticorpilor, acestea sunt transferate din gel într-o membrană de nitroceluloză sau fluorură de poliviniliden ( PVDF ). Principala metodă de transfer se numește „ electroblotare ” și folosește curent electric pentru a transfera proteinele din gel în membrană. Proteinele se deplasează de la gel la membrană menținând în același timp organizația prezentă în gel. O metodă mai veche de transfer este de a pune o membrană peste gel și straturi de hârtie de filtru peste ea. Întregul este plasat într-o soluție tampon care se deplasează în sus de filtru prin capilaritate , luând proteinele cu el. Ultima metodă nu este utilizată deoarece durează prea mult. Este preferată electroblotarea . Ca urmare a ambelor procese de ștergere, proteinele sunt expuse pe o suprafață subțire pentru detectare (vezi mai jos). Diferite membrane sunt alese pentru proprietățile lor nespecifice de legare la diferite proteine. Legarea de proteină se bazează pe interacțiuni hidrofobe , precum și pe interacțiunile dintre membrană și proteină. Membranele nitrocelulozice sunt mai ieftine decât membranele PVDF , dar mult mai fragile și nu sunt ușor de reutilizat.

Western blot transfer.png

Uniformitatea și transferul eficient al proteinelor din gel în membrană pot fi verificate prin colorarea membranei cu Coomassie Blue sau Ponceau S. Ponceau S este cel mai comun dintre cele două, datorită sensibilității și solubilității sale ridicate în apă, care este mai ușor de decolorat pentru a analiza membrana, așa cum este descris mai jos. [5]

Blocare

După alegerea membranei pentru capacitatea sa de a lega proteina, este necesar să se prevină interacțiunile dintre membrană și anticorpul utilizat pentru a detecta proteina țintă. Blocarea legăturilor nespecifice se realizează prin plasarea membranei într-o soluție diluată de proteine ​​- de obicei 3-5% albumină serică bovină (BSA) sau lapte praf în soluție salină tris-tamponată (TBS), cu un procent mic de detergent precum Tween 20 sau Triton X-100 . Proteina din soluția diluată se atașează la membrană în toate punctele în care proteinele țintă nu au prins rădăcini. Acest lucru permite, atunci când anticorpul este adăugat, să nu se lege de site-uri nespecifice, deoarece acestea sunt deja ocupate de proteina menționată anterior. Acest lucru reduce „ zgomotul ” produsului final, ducând la rezultate mai curate și eliminând falsurile pozitive.

Detectare

În timpul procesului de detectare, membrana devine specimenul proteinei de interes cu un anticorp modificat care este legat de o enzimă mesager; atunci când este expusă la un substrat adecvat, această enzimă creează o reacție colorimetrică și produce o culoare . Din mai multe motive, acest proces a fost în mod tradițional în doi pași („în doi pași”), deși există metode pentru procesele cu un singur pas („un pas”) pentru anumite aplicații.

Doi pasi

  • Anticorp primar

Anticorpii primari sunt generați atunci când speciile gazdă sau culturile de celule imune sunt expuse la proteina de interes (sau o parte apropiată de aceasta). În mod normal, aceasta face parte din răspunsul imun, unde sunt crescute și utilizate ca dispozitive de detectare specifice care leagă direct proteina. După blocare , o soluție diluată de anticorp primar (în general între 0,5 și 5 µg / ml) este incubată cu membrana prin agitare ușoară. De obicei, soluția constă dintr-o soluție tampon cu un procent mic de detergent și, uneori, cu lapte praf sau BSA . Soluția de anticorp și membrana pot fi sigilate și incubate împreună timp de 30 de minute sau peste noapte. De asemenea, poate fi incubat la temperaturi diferite (legături mai puternice sunt asociate la temperaturi mai calde) atât pe proteina specifică (țintă, „ semnalul ”), cât și nespecifică („ zgomotul ”).

  • Anticorp secundar

După clătirea membranei pentru a îndepărta anticorpul primar nelegat, un alt anticorp este asociat cu membrana, vizând o specie specifică de anticorp primar. Anticorpii provin de la animale (sau culturi hibride de origine animală, hibridomi ), un anticorp secundar de șoarece se va lega de orice anticorp primar de șoarece, permițând economii de costuri, permițând unui întreg laborator să împartă o singură sursă de anticorp produs și oferă rezultate mai bune. Acesta este cunoscut ca un anticorp secundar și, având în vedere proprietățile sale țintă, este denumit „anti-șoarece”, „anti-capră” etc. Anticorpul secundar este de obicei legat de biotină sau de o enzimă mesageră, cum ar fi fosfataza alcalină sau Armoracia rusticana peroxidaza . Aceasta înseamnă că mai mulți anticorpi secundari se vor lega de un anticorp primar, crescând semnalul. În mod obișnuit, o legătură secundară peroxidază Armoracia rusticana este utilizată pentru a împărți un agent chemiluminescent , iar reacția produsă emite luminescență proporțională cu cantitatea de proteine. Un film fotografic este plasat pe membrană; expus la lumina reacției creează o imagine a anticorpilor legați de pete. Un sistem mai ieftin folosește un colorant de 4% cloronaftol cu ​​peroxid de hidrogen de 1%; reacția radicalilor peroxidici cu 4-cloronaftol produce o culoare violet închis, permițând fotografierea fără a folosi pelicule specifice.

Western Blot binding.png

Ca și în cazul ELISPOT și ELISA , enzima poate fi dată de un substrat de molecule care poate fi transformat de enzimă într-un produs de reacție colorat vizibil pe membrană (vezi benzile albastre din figura de mai jos). O altă metodă de detectare secundară a anticorpului folosește un anticorp legat de fluor în apropiere de infraroșu (NIR). Lumina produsă de excitația vopselei fluorescente este statică, permițând detectarea exactă a diferențelor de semnal produse de anticorpii etichetați legați de proteine ​​pe Western blot. Proteinele pot fi cuantificate deoarece semnalul generat de diferența în cantitatea de proteine ​​de pe membrane este măsurat într-un mod static, comparativ cu chemiluminescența , unde lumina este măsurată într-o stare dinamică. [6] O a treia alternativă este de a utiliza etichete radioactive mai degrabă decât o enzimă cuplată la anticorpul secundar, precum și de a marca o proteină de anticorp care nu se leagă, cum ar fi proteina Staphylococcus A sau Streptavidin cu un izotop radioactiv de iod . Deoarece alte metode sunt mai sigure, mai rapide, mai ieftine, aceasta este acum cea mai puțin utilizată; avantajul acestei metode este sensibilitatea radiografică care permite cuantificări foarte precise ale proteinelor, atunci când este asociată cu software specific (de exemplu, Optiquant).

Un pas

Din punct de vedere istoric, procesul de eșantionare a fost realizat în două etape datorită simplității relative a producerii anticorpilor primari și secundari în procese separate. Acest lucru oferă cercetătorilor multe avantaje în ceea ce privește flexibilitatea și adaugă amplificare în detectare. Având în vedere apariția analizelor de proteine ​​de înaltă eficiență și a limitelor inferioare de detectare, a existat interes în dezvoltarea sistemelor într-un singur pas care să permită o execuție mai rapidă și mai puține consumabile. Acest lucru necesită un specimen de anticorp care detectează proteina de interes și conține o etichetă detectabilă, specimene care sunt adesea disponibile pentru proteina țintă . Specimenul primar este incubat cu membrana într-un mod similar cu cel al anticorpului primar într-un proces în două etape și, prin urmare, este gata pentru detectarea directă după o serie de spălări.

Analize

După ce specimenele nelegate sunt spălate, Western blot este gata pentru detectarea specimenelor care sunt etichetate și legate de proteina de interes. Nu toate Western blot dezvăluie proteine ​​într-o singură bandă a membranei. Dimensiunile aproximative sunt luate din comparația benzilor colorate în raport cu markerul sau scara încărcată în timpul electroforezei . Procesul se repetă pentru o proteină structurală, cum ar fi actina sau tubulina , care nu se schimbă între probe. Cantitatea de proteină țintă este normalizată la proteina structurală care trebuie controlată în grupuri. Această practică asigură corecții pentru cantitatea totală de proteine ​​de pe membrană, în caz de erori sau transferuri incomplete.

Detectare colorimetrică

Detectarea colorimetrică depinde de incubarea Western blot cu un substrat care reacționează cu enzima reporter (cum ar fi peroxidaza ) legată de anticorpul secundar. Aceasta transformă colorantul solubil în forma insolubilă a diferitelor care precipită în apropierea enzimei și, prin urmare, colorează membrana. Dezvoltarea petei este oprită prin spălarea coloranților. Nivelurile de proteine ​​sunt evaluate cu densitometrie (mai mare acolo unde sunt mai colorate) sau spectrofotometrie .

Detectarea cu chemiluminescență

Metodele cu detectare chemiluminiscentă depind de incubarea western blot cu un substrat care emite lumină atunci când este expus la reporterul anticorpului secundar. Lumina este detectată de filmul fotografic și, mai recent, de senzorii CCD care captează o imagine digitală a western blot. Imaginea analizată cu densitometrie detectează cantitatea de proteină colorantă și cuantifică rezultatele în termeni de densitate optică. Un nou software permite analize suplimentare, cum ar fi greutatea moleculară .

Western blot chemiluminescent detection.png

Detectarea radioactivă

Etichetele radioactive nu necesită substraturi enzimatice, permițând poziționarea filmelor cu raze X direct împotriva Western blot care dezvoltă, cu expunere, zone întunecate corespunzătoare proteinei de interes. Este o tehnică costisitoare și periculoasă, mai bine să preferați alternativa ECL (chemiluminescență îmbunătățită).

Western blot cu sistem de detectare radioactivă

Detectare fluorescentă

Specimenul fluorescent este excitat de lumină și emisia excitației este detectată de fotosenzori, cum ar fi CCD-urile echipate cu filtre adecvate care captează o imagine digitală a Western blot; aceasta permite analize suplimentare, cum ar fi greutatea moleculară și o analiză cantitativă a Western blot. Detectarea fluorescentă este considerată una dintre cele mai bune metode de cuantificare, deși mai puțin sensibilă decât chemiluminescența . [7]

Test secundar

Diferența majoră între membranele de nitroceluloză și PVDF este capacitatea de a sprijini îndepărtarea anticorpilor pentru reutilizarea membranei cu probele ulterioare. În timp ce există protocoale bine definite pentru membranele de nitroceluloză, cele din PVDF permit numeroase reutilizări înainte de a pierde sensibilitatea. O altă diferență este că, spre deosebire de nitroceluloză, PVDF trebuie păstrat într-o soluție 95% de etanol , izopropanol sau metanol , înainte de utilizare. Membranele PVDF tind să fie mai subțiri și mai puternice în utilizare.

Electroforeza 2D

Pictogramă lupă mgx2.svg Același subiect în detaliu: electroforeză bidimensională .

Electroforeza bidimensională sau electroforeza 2D este un tip de tehnică electroforetică utilizată în domeniul proteomicii pentru separarea amestecurilor complexe de proteine ​​(adică formate din mai multe specii de proteine ​​diferite), cum ar fi un amestec de proteine extrase dintr-o celulă la un moment dat în ciclu.telefon mobil . Tehnica, așa cum sugerează și numele, constă din două dimensiuni ortogonale de-a lungul cărora sunt separate diferitele proteine. În proteomică, termenul ortogonal indică în general două dimensiuni de-a lungul cărora se produce separarea prin exploatarea unor principii fizice diferite, care nu sunt influențate una de cealaltă. În cazul electroforezei bidimensionale, principiile cele mai utilizate sunt punctul izoelectric și greutatea moleculară .

Aplicații de diagnostic medical

  • Testul HIV utilizează un western blot pentru a detecta anticorpii HIV într-o probă de plasmă umană. Proteinele din celulele din țesuturile infectate cu HIV sunt separate și șterse pe o membrană. Ulterior, serul de testat se aplică în faza primară de incubație a anticorpilor; anticorpii liberi sunt spălați, se adaugă un anticorp anti-uman secundar legat de un semnal enzimatic. Benzile colorate indică proteinele în care serul pacientului conține anticorpi.
  • Un western blot este utilizat ca test definitiv pentru encefalopatia spongiformă bovină (ESB, "vaca nebună").
  • Unele forme de boală Lyme sunt diagnosticate cu Western blot.
  • Western blot poate fi utilizat pentru confirmarea cazurilor de hepatită C.
  • În medicina veterinară , Western blot este utilizat pentru a confirma pozitivitatea FIV la pisici.

Protocoale

Notă

  1. ^ Towbin H, Staehelin T, Gordon J., Transfer electroforetic de proteine ​​din geluri de poliacrilamidă în foi de nitroceluloză: procedură și unele aplicații , în Proceedings of the National Academy of Sciences USA , vol. 76, nr. 9, 1979, pp. 4350–54, DOI : 10.1073 / pnas.76.9.4350 , PMC 411572 , PMID 388439 .
  2. ^ Renart J, Reiser J, Stark GR., Transferul proteinelor din geluri în diazobenziloximetil-hârtie și detectarea cu antiseruri: o metodă pentru studierea specificității anticorpilor și a structurii antigenului , în Proceedings of the National Academy of Sciences USA , vol. 76, nr. 7, 1979, pp. 3116-20, DOI : 10.1073 / pnas.76.7.3116 , PMC 383774 , PMID 91164 .
  3. ^ a b Anticorp Western blot , la exactantigen.com . Adus la 29 ianuarie 2009 (arhivat din original la 17 decembrie 2009) .
  4. ^ Burnette WN., „Western blot”: transfer electroforetic de proteine ​​din dodecil sulfat de sodiu - geluri poliacrilamidice în nitroceluloză nemodificată și detectare radiografică cu anticorp și proteină radioiodată A , în Biochimia Analitică , vol. 112, nr. 2, 1981, pp. 195–203, DOI : 10.1016 / 0003-2697 (81) 90281-5 , ISSN 0003-2697 ( WC ACNP ) , PMID 6266278 .
  5. ^ Corley RB., A Guide to Methods in the Biomedical Sciences , Springer, 2005, p. 11, ISBN 978-0-387-22844-0 .
  6. ^ Ambroz K., Îmbunătățirea preciziei de cuantificare pentru western blots ( PDF ), în Image Analysis , 20 septembrie 2006 (arhivat din original la 29 august 2008) .
  7. ^ Sisteme de imagistică pentru occidentali: chemiluminescență vs. Detectarea cu infraroșu, 2009 -, Metode în biologie moleculară, blotarea și detectarea proteinelor, vol. 536 ( PDF ) [ link rupt ] , pe springerlink.com , Humana Press. Adus la 26 februarie 2010 .

Elemente conexe

Alte proiecte

linkuri externe

Estratto da " https://it.wikipedia.org/w/index.php?title=Western_blot&oldid=122257835 "