Electroforeză bidimensională
Electroforeza bidimensională sau electroforeza 2D este un tip de tehnică electroforetică utilizată în domeniul proteomicii pentru separarea amestecurilor complexe de proteine (adică formate din mai multe specii de proteine diferite), cum ar fi un amestec de proteine extrase dintr-o celulă la un moment dat în ciclu.telefon mobil .
Tehnica, așa cum sugerează și numele, constă din două dimensiuni ortogonale de-a lungul cărora sunt separate diferitele proteine. În proteomică, termenul ortogonal indică în general două dimensiuni de-a lungul cărora se produce separarea prin exploatarea unor principii fizice diferite, care nu sunt influențate una de cealaltă. În cazul electroforezei bidimensionale, principiile cele mai utilizate sunt punctul izoelectric și greutatea moleculară .
Pentru analize comparative, este esențial să aveți un grad ridicat de reproductibilitate:
- reducerea variabilității probei biologice
- reducerea variabilității experimentale
- analiza statistică precisă a datelor produse
Prima dimensiune
Prima dimensiune utilizează de obicei un gradient de pH atins datorită moleculelor amfotere care sunt făcute să migreze într-un suport, constituit în general dintr-un gel de poliacrilamidă , plasat într-un câmp electric . În ultimii ani s-a răspândit în laboratoare benzi (benzi) prefabricate, în care sunt imobilizate amfolitul ; în timpul polimerizării, gelul care formează benzile este supus unui câmp electric extern, astfel încât gradientul de pH să fie generat. Acest sistem pe benzi garantează o stabilitate mai mare a gradientului și o reproductibilitate experimentală ridicată. Proba este încărcată pe gel; câmpul electric aplicat face ca proteinele, prezente sub formă de ioni , să se miște până ajung la punctul lor izoelectric, deoarece fiecare moleculă este sub forma unui zwitterion cu o sarcină totală egală cu zero. Procesul descris se numește izoelectrofocus (IEF sau izoelectrofocus )
A doua dimensiune
În timpul celei de-a doua dimensiuni , proba este tratată cu SDS ( dodecil sulfat de sodiu ) pentru a da tuturor proteinelor o sarcină electrică negativă netă. Apoi urmează un SDS-PAGE clasic în care speciile de proteine se împart în funcție de greutatea lor moleculară. Proteinele sunt evidențiate în cele din urmă prin colorare, folosind de exemplu Coomassie albastru sau azotat de argint .
Hărțile obținute sunt apoi analizate cu un densitometru : fiecare pixel este asociat cu o valoare de absorbție care este proporțională cu concentrația proteinelor prezente în acel pixel.
Atunci când se compară două probe, este important să se execute trei până la nouă replici pentru fiecare probă și să se ruleze trei până la nouă replici analitice pentru fiecare replică biologică.
Replicatele biologice anulează variabilitatea biologică în timp ce replicile analitice anulează variabilitatea experimentală. În cele din urmă, din compararea mai multor hărți, este posibil să se detecteze diferențe statistice semnificative în expresia genelor .
Electroforeză cu gel diferențial bidimensional (DiGE)
O îmbunătățire a electroforezei bidimensionale a fost adusă odată cu apariția tehnicii DiGE în care proteinele sunt marcate înainte de a fi analizate. Cu tehnica DiGE este, de asemenea, posibilă încărcarea mai multor probe la un moment dat, deoarece o moleculă este legată de fiecare probă care produce o fluorescență diferită. Proteinele sunt marcate cu molecule numite cianine care acționează ca coloranți prin legarea grupării amino libere a reziduurilor de lizină.
Bibliografie
- (EN) Bandow J, Baker JD, Berth M, Painter C, și colab., Flux de lucru îmbunătățit pentru analiza imaginii pentru geluri 2-D Permite studii la scară largă de proteomică pe bază de gel 2-D - Studii de descoperire a biomarkerului BPOC , în Proteomics, vol. 8, nr. 15, 2008, pp. 3030-3041, DOI : 10.1002 / pmic.200701184 .
- ( RO ) M. Berth, FM Moser, M. Kolbe și J. Bernhardt, Stadiul tehnicii în analiza imaginilor bidimensionale cu electroforeză pe gel , în Appl Microbiol Biotechnol , vol. 76, 2007, pp. 1223–1243, DOI : 10.1007 / s00253-007-1128-0 . PDF (licență Springer Open Access) [ link rupt ]
Elemente conexe
Alte proiecte
-
Wikimedia Commons conține imagini sau alte fișiere despre electroforeză bidimensională
