Radioimunotest

Tehnica radioimunologică , cunoscută în mod obișnuit sub numele de RIA ( Radio Immuno Assay ), este o tehnică de laborator utilizată pentru a testa orice compus imunogen disponibil sub formă pură și etichetabilă radioactiv . Are o sensibilitate ridicată ( ordinul pg / ml ), specificitate ridicată, precizie ridicată.

Are unele dezavantaje, cum ar fi costul ridicat al echipamentelor și al reactivilor , durata de viață a reactivilor și pericolele radiologice asociate cu utilizarea reactivilor radioactivi.

Invenția sa i-a adus Rosalyn Yalow Premiul Nobel pentru medicină în 1977 .

Aplicații

Tehnica radioimunologică este frecventă în diferite domenii clinice: diagnosticarea diabetului (dozare de insulină ), hipertensiune arterială , boli legate de disfuncția tiroidiană și hormonul de creștere , dozarea în sânge a medicamentelor sau aplicații medico-legale (antidoping).

Metoda

Elementele cheie ale testului sunt: anticorpul (Ab, clasa IgG ) specific pentru antigenul care urmează să fie determinat (Ag), proba care conține Ag și Ag marcat radioactiv (Ag *) în formă pură (de obicei iod -125 este utilizat în marcare, odată ce s-a folosit tritiu ).

Există 3 tipuri de RIA:

Dozare pentru concurență obligatorie sau deplasare

O primă reacție este efectuată pentru formarea complexului Ag * Ab:

Ag * + Ab ---> Ag * Ab

A doua reacție de deplasare a antigenului marcat este apoi efectuată (anticorpul nu „distinge” între antigenul marcat și cel nemarcat) folosind proba care trebuie măsurată ca antigen „rece”:

Ag * Ab + Ag ---> Ag * Ab + AgAb

Dozajul de echilibru

Este cel mai comun tip. În acest caz, antigenul marcat și nemarcat sunt incubate simultan.

Dozare secvențială

În primul rând, se efectuează reacția dintre anticorpul în exces și antigenul nemarcat; apoi siturile anticorpilor liberi sunt saturate cu antigenul marcat.

Interpretarea rezultatului și a curbei de calibrare

În toate metodele, cu cât concentrația de antigen neradioactiv este mai mare, cu atât este mai mică cantitatea de antigen marcat radioactiv legat de anticorp. Pentru a interpreta aceste date, se utilizează o curbă specială de calibrare care este produsă prin adăugarea unor cantități cunoscute și crescătoare de antigen rece la amestecul de echilibru cu antigenul marcat. Curba arată în mod evident o tendință descendentă a fracției legate de creșterea concentrației antigenului „rece”. Un "gol" este apoi scăzut din valoarea curbei care reprezintă legarea nespecifică a izotopului radioactiv conținut în fracția legată. Valoarea concentrației antigenului din proba de măsurat se obține prin interpolare a valorii radioactivității măsurate cu această curbă.

Prezența unui "gol" în fracția legată este secundară diferiților factori:

separarea nu perfectă între fracția legată și fracția liberă datorită prinderii mecanice de către aceasta din urmă în prima. Prin spălarea precipitatului această eroare este redusă.
adsorbția izotopului radioactiv pe pereții tubului.
caracteristici chimico-fizice similare între fracțiunea liberă și legată.
prezența unor substanțe străine contaminante marcate.
separarea imprecisă a celor două fracții.

Capacitatea maximă de legare este egală cu cantitatea de antigen marcat legat în absența antigenului „rece”. De obicei, în teste, intervalul de valori în care testul este evaluabil este între 25% și 75% din această valoare. De fapt, numărările referitoare la concentrații în afara acestui interval nu pot fi evaluate, deoarece sunt foarte influențate de întâmplare . De fapt, valorile prea mari pot să nu se lege în mod adecvat de anticorp și valorile prea mici pot fi dificil de detectat.

Metode de separare a fracției legate

Metoda ideală de separare ar trebui să fie „clară” în separarea celor două faze (legată și nelegată), simplă, ieftină, rapidă, care să nu interfereze cu reacția antigen-anticorp și să nu fie influențată de substanțe străine. Nicio metodă nu îndeplinește pe deplin toate aceste cerințe, dar există încă mai multe alternative; pe lângă separarea prin cromatografie pe coloană făcută mai rar (fracția legată „migrează” mai repede și centrifugarea poate fi utilizată pentru a face acest proces mai rapid și mai automatizat).

Precipitarea complexelor imune cu săruri și / sau solvenți

Aceste substanțe ( polietilen glicol , etanol , sulfat de amoniu ) fac insolubile complexele antigen-anticorp dacă sunt adăugate la amestecul de reacție prin „deplasarea” moleculelor de apă de solvație ale acestor complexe. Cantitatea acestor substanțe care trebuie utilizate variază în funcție de compoziția mediului în care acționează și este determinată prin intermediul unor curbe speciale create folosind amestecuri crescânde de substanță separatoare cu sau fără anticorp. O centrifugă poate fi, de asemenea, utilizată pentru a accelera procesul. Cantitatea de substanță adăugată este apoi aleasă astfel încât să fie cât mai selectivă posibil în separarea celor 2 faze. Metoda este simplă și ieftină, dar are dezavantajele că nu este specifică și că este influențată de variabile precum pH - ul , temperatura și concentrația diferitelor componente ale amestecului de reacție.

Imunoprecipitare prin al doilea anticorp ( tehnica dublu anticorp )

Acesta constă în precipitarea complexului antigen-anticorp care trebuie detectat prin adăugarea unei cantități adecvate de anticorp direcționat împotriva acestui complex (de obicei împotriva lanțului Fc al primului anticorp). Este posibil să se realizeze atât o pre-precipitare (formez complexul înainte de a -l face să reacționeze cu antigenii), cât și o post-precipitare (adaug al doilea anticorp după adăugarea de antigeni). Prima tehnică are un avantaj datorită faptului că precipitarea imunocomplexului nu este influențată de substanțele străine prezente în serul pacientului, dar este totuși mai puțin sensibilă decât a doua datorită interferenței celui de-al doilea anticorp în reacția de aglutinare a antigenului și necesită o cantitate mai mare de anticorp în sine. Această metodă are avantajele de a fi specifică, fiind utilizabilă în multe reacții RIA, precum și de a fi destul de independentă de factorii de mediu, cum ar fi pH-ul și temperatura. Are ca dezavantaje un cost și o complexitate mai mari (mai mulți pași și mai mulți reactivi utilizați), posibilitatea reacției încrucișate a celui de-al doilea anticorp cu Ig seric și un timp mai lung pentru a obține rezultatul (care poate fi redus de la zile la minute cu combinând în soluție și solvenți precum polietilen glicol)

Adsorbția nespecifică a antigenului

Cărbunele și carbon- dextranul pot fi utilizate în separarea fracției legate atunci când cele două fracții au dimensiuni și sarcină electrică foarte diferite, deoarece adsorbția moleculelor mai mari și încărcate de pe suprafața sa este favorizată față de cele mici cu sarcină mică. Prin urmare, această metodă nu este adecvată în reacțiile în care antigenele sunt molecule mari în sine sau în cazul virușilor . Centrifugarea, de asemenea, în acest caz poate accelera procesul. Alți adsorbanți utilizabili sunt rășinile schimbătoare de ioni , silice , hidroxiapatită și talc . Concentrația optimă de carbon care urmează să fie utilizată în reacții este, de asemenea, determinată în acest caz prin intermediul unor curbe speciale efectuate folosind probe cu și fără anticorp la doze crescute de separator. Această tehnică are avantajele de a necesita un singur pas, de a fi rapidă, ieftină și reproductibilă. Este utilizat numai în dozarea haptenelor și a moleculelor mici pentru caracteristicile descrise mai sus. Dezavantajele constau în faptul că variațiile concentrației proteinelor, pH-ului, puterii ionice, timpul de reacție și temperatura influențează separarea (necesitatea standardizării procesului) și posibilitatea unor antigeni de a se detașa de imunocomplex, în special cu o afinitate mai mică Ig.

Adsorbția în fază solidă a anticorpului

Anticorpii sunt aderați la faza solidă lăsându-i în contact cu ea câteva ore și apoi spălându-i. Situl de contact nu trebuie să interfereze în mod evident cu reacția antigen-anticorp și reacția RIA are loc între antigenul marcat și nemarcat care concurează pentru situsurile anticorpilor liberi. Procesul de aderență, care are loc prin legături hidrofobe , este influențat de Ph (bazic, de preferință de la 8,5 la 10), de puterea ionică , de timpul de contact și de concentrația de Ig în soluție (prea mulți Ig aderați la tuburile pot afecta, de asemenea, legarea antigenului prin obstacole sterice ). Glutaraldehida poate fi, de asemenea, utilizată în unele cazuri pentru a face legarea din tuburi mai stabilă și acestea trebuie păstrate la 4 ° C. În plus față de peretele de plastic al eprubetelor, Ig poate adera, de asemenea, la boabe de separoză , discuri de hârtie, sticlă sau celuloză activate cu bromură de cianogen (care reacționează cu grupările amino ale Ig prin legarea lor la suport), particule sau magnetizate cu magnetit care permite prin intermediul unui câmp magnetic adecvat separarea lor de fracțiunea liberă. O altă tehnică constă în adsorbția unui al doilea anticorp la tuburile la care se adaugă apoi primarul înainte de reacție; acest lucru mărește siturile disponibile pentru antigen. Principalul avantaj al acestor tehnici constă în separarea ușoară între cele două fracții. Dezavantajele sunt necesitatea unor cantități mai mari de anticorp și complexitatea reacțiilor de adsorbție, pe lângă faptul că procedura limitează situsurile de contact pentru antigen. Mai mult, cinetica reacției anticorpilor este mai lentă, deoarece antigenii trebuie să vină în mod necesar în contact cu faza solidă pentru a reacționa.

Separarea prin proteina A

Proteina A este o substanță produsă de Staphylococcus aureus capabilă să lege porțiunea Fc (invariantă) a IgG de mamifere. Prin urmare, poate fi utilizat ca alternativă la anticorpul dublu în testele RIA. Metoda de separare este rapidă, nu este necesară o perioadă de incubație și este suficient să centrăm tubul pentru a separa cele două faze.

Elemente conexe

Test imunoradiometric

linkuri externe

( EN ) Radioimmunoassay , în Encyclopedia Britannica , Encyclopædia Britannica, Inc.
( EN ) https://web.archive.org/web/20100612024430/http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/Radioimmunoassay.html

Controlul autorității	Tesauro BNCF 4532 · LCCN (EN) sh85110708 · BNF (FR) cb119529016 (data)