Recombinarea
Recombinarea (din ingineria recombinării ) este o tehnică de modificare a ADN bazată pe recombinarea omoloagă a Escherichia coli .[1]
În special, sistemul de recombinare omolog este oarecum diferit de cel clasic al gazdei bacteriene bazat pe proteinele RecBCD și RecA. Sistemul de recombinare omolog utilizat în recombinare este caracterizat de o activitate de exonuclează , reprezentată de proteina Redalpha (5 '> 3' exonuclează) și de o activitate de recoacere reprezentată de Redbeta. Ambele proteine sunt codificate de fagul lambda (genele exo și respectiv bet). O a treia proteină (Redgama, codificată de gena gam ) crește eficacitatea acestui sistem prin inhibarea activității exonucleazei gazdei (RecBCD). Ca alternativă la acest sistem, este posibil să se utilizeze cel bazat pe proteinele RecE și RecT. Acest sistem, deși nu este întru totul similar cu cel bazat pe Redalpha și Redbeta, împarte aceleași activități enzimatice cu sistemul Redalpha / Redbeta.
Principala caracteristică a recombinării omoloage care are loc în timpul reacției de recombinare este prezența unor regiuni de omologie la ADN în care să se recombine, la fel de mici ca 30 de nucleotide , pe ambele părți ale ADN-ului recombinant. Această regiune de omologie poate fi ușor inserată în oligonucleotide utilizate pentru a amplifica ADN-ul recombinant prin PCR . Metodologia recombinării înlocuiește treptat cea bazată pe utilizarea enzimelor de restricție și a ligazelor ADN pentru a proiecta ADN-ul. Acesta este în special cazul în care ADN-ul care trebuie modificat este reprezentat de construcții mari, cum ar fi BAC , PAC, ADN cromozomial etc.
Notă
- ^ Ellis, HM, D. Yu, T. DiTizio și DL Court, (2001) Mutageneză de înaltă eficiență, reparare și inginerie a ADN-ului cromozomial utilizând oligonucleotide monocatenare. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6742-6746 DOI : 10.1073 / pnas.121164898
