Expresie heterologă
Expresia heterologă este un proces care permite exprimarea proteinelor specifice într-un organism care nu le-ar produce în mod normal. Este o ramură a ingineriei genetice cunoscută sub numele de genetică aplicată .
Acest proces necesită două lucruri:
- gena de interes
- sistemul de exprimare
Cum se găsește gena de interes
În primul rând, este necesar să aveți la dispoziție bibliotecile, adică baze de date genetice ale vectorilor care conțin inserții genetice reprezentative pentru întregul genom al unui organism. Acești vectori (BAC, YAC, bacmide, cosmide ...) sunt la rândul lor inserate în microorganisme pentru a fi conservate și reproduse. Biblioteca poate fi definită ca atare numai dacă poate permite identificarea genei de interes și dacă permite izolarea vectorului care o conține.
Pentru a găsi gena de interes, trebuie să fiți conștienți de cel puțin una dintre aceste informații:
- Secvența genică
- Secvența de aminoacizi tradusă de genă
- Funcția biochimică a proteinei codificate
În funcție de tipul de informații disponibile, există diferite metode de identificare.
Disponibilitatea secvenței genetice
Cu aceste informații este posibil să se creeze primeri complementari genei de interes, astfel încât să se poată lega de ea. Practic implică transferul bibliotecii pe un filtru de nitroceluloză cu tehnica de placare a replicării, lizarea celulelor și denaturarea ADN-ului. În acest moment, filtrul este expus primerului marcat (care poate conține un fluorofor) permițând recoacerea pentru a înțelege în care dintre coloniile bibliotecii este prezent vectorul care conține gena de interes.
Disponibilitatea secvenței de aminoacizi
Din această secvență este posibilă urmărirea secvenței bazelor care s-au codificat pentru polipeptidă , dar din moment ce codul genetic este degenerat (adică un aminoacid este codificat de mai mulți triplete), s-ar putea obține un grup foarte mare de posibili primeri, toate acestea să fie testate., apoi continuând ca la metoda anterioară.
Alternativ, este posibil să se creeze anticorpi specifici (Ab) capabili să lege o secvență specifică de aminoacizi a polipeptidei codificate. Funcționează astfel: Ab1 modificat leagă peptida, colonia este expusă unui Ab2 (de care este legată enzima 2-galactozidază) capabil să recunoască Ab1. Dacă X-gal (colorant) este prezent în mediul în care cresc coloniile, acesta este catalizat și capătă o culoare albastră care poate fi văzută cu ochiul liber. În acest caz, este necesară exprimarea vectorului.
Disponibilitatea funcției biochimice
Având aceste informații, acționăm prin completarea fenotipului mutant, adică în acest fel: vrem să înțelegem în ce vector al bibliotecii este prezentă gena care codifică proteina A. Luăm tulpini bacteriene mutante A și TRP. Aceste tulpini sunt transformate cu vectorii prezenți în bibliotecă (toate conținând markerul selectabil TRP +). În cele din urmă, tulpinile sunt plasate pe mediu care nu conține A și se lasă să crească. Se obține următorul rezultat:
- celulele care nu au primit vectorul nu sunt în măsură să crească deoarece nu pot produce nici TRP, nici A.
- celulele care au primit plasmida, pe de altă parte, produc toate TRP, dar numai cele care produc și A pot crește (deoarece nu este disponibil în mediu).
În acest fel, pot fi selectate celulele care conțin vectorul cu gena pentru A.
Modelează microorganismele
Cele mai utilizate microorganisme în genetică sunt:
- Escherichia coli ,
- Bacillus subtilis ,
- Kluyveromices lactis ,
- Pichia pastoris,
- Saccharomyces cerevisiae .
Vectorii de expresie
Vectorul de expresie este cel mai important factor al întregului mecanism de producție și acest lucru se datorează faptului că trebuie să conțină toate semnalele necesare pentru ca organismul gazdă să transcrie gena, să o traducă în polipeptidă, să efectueze modificări post-translaționale, să secrete proteina. Aceste semnale sunt diferite și variază în funcție de sistemul de exprimare.
Promotor
Promotorul este o secvență localizată în amonte de secvența de codificare recunoscută într-un mod foarte similar de ARN polimeraza II și care permite inițierea transcripției. Un promotor utilizat pentru exprimarea genelor heteroloage trebuie să fie:
- PUTERNIC: afinitate ridicată cu ARN polimeraza II astfel încât, odată ce începe expresia, totalul proteinelor exprimate de celulă este alcătuit din 30% din cel de interes.
- REGULAT: adică inductibil sau dereprimibil într-un mod simplu prin exploatarea sistemelor binare ON / OFF similare cu cele bacteriene.
Apropo de cei mai utilizați promotori găsim:
- Promotor TRP
- Promotor LAC
- Promotor ARABAD
- Promotorul său
Terminator
Terminatorul este o secvență capabilă să instruiască ARN polimeraza II să pună capăt transcripției. Rezilierea poate avea loc în două moduri:
- printr-un terminator intrinsec
- într-un mod dependent de Rho
Traducere heterologă
Sistemul de traducere funcționează în același mod în aproape toate organismele vii, cu excepția faptului că procesul își variază semnalele de la procariote la eucariote. Semnalele necesare sunt:
- AUG începe
- RBS (site de legare ribozomală)
- STOP codoni
În special, RBS este cunoscut ca secvența Shine-Dalgarno pentru procariote și secvența Kozak pentru eucariote . Aceste secvențe au aceeași funcție, dar nu sunt interschimbabile între ele, trebuie să o folosim pe cea necesară sistemului nostru de expresie pentru a permite atacul ribozomilor.
Probleme de traducere
Procesul de traducere, deși universal, are unele excepții care trebuie luate în considerare pentru exprimarea unei proteine într-un alt organism decât cel original, pentru a se asigura că produsul final este în orice caz identic cu cel dorit.
Una dintre problemele mai puțin frecvente, dar care trebuie luată în considerare, este că unele organisme fac o excepție în unele codificări ale codonilor de traducere, de aceea este necesar să se constate, înainte de a exprima, că sistemul de codificare este același să fie cu o polipeptidă diferită de cea așteptată. Această problemă poate fi rezolvată prin crearea unei noi versiuni a genei (prin mutageneză specifică site-ului, dacă diferențele sunt mici) compatibilă cu gazda.
O altă problemă de găsit derivă din faptul că unele organisme exploatează de preferință anumiți codoni pentru a codifica un aminoacid mai degrabă decât altele și, în consecință, exprimă mai mult aminoacil-t-rna . Consecința este că traducerea ar putea fi încetinită sau chiar întreruptă. Pentru a rezolva această problemă, este posibil, ca în cazul anterior, să construim o nouă versiune compatibilă a genei sau să exprimăm în gazdă, în cantități mari pe o plasmidă separată, t-rna necesară pentru traducere.
Alte probleme includ posibilitatea de a găsi un f-met la N-terminal, de obicei menținut în sistemele de expresie procariote. Este posibil ca acest aminoacid modificat să nu fie irelevant pentru plierea și funcția produsului final. Pentru a elimina acest element, puteți proceda în două moduri:
- Introduceți în genă o secvență pentru direcționarea periplasmatică: în acest fel proteina este codificată și coada de la N-terminal tăiată (împreună cu f-met) odată ce a intrat în periplasmă .
- Creați o secvență N-terminală alungită care conține o pereche de PRO-uri. Apoi lăsați gazda să exprime o enzimă, cunoscută sub numele de " dipeptilamino dipeptidază I ", capabilă să taie perechi de aminoacizi începând chiar de la capătul N-terminal și oprindu-se numai după tăierea unei perechi de PRO. Aceasta elimină și f-met.
La sfârșitul lucrării, indiferent de tehnica pe care decideți să o urmați, este important să vă amintiți că proteina finală trebuie să aibă:
- aceeași funcție
- aceeași secvență primară
- aceeași pliere
- aceleași modificări post-traducere
Probleme de proteoliză
Toate celulele conțin proteaze endogene capabile să distrugă unele structuri proteice care sunt inutile pentru supraviețuirea celulei în sine. În general proteinele atacate de aceste enzime sunt proteine incomplete, subunități în exces, proteine slab traduse sau degradate. Cu toate acestea, datorită ingineriei genetice, celulele sunt capabile să producă cantități mari de proteine, chiar și neendogene, care, în general, nu sunt utile celulei, care apoi decide să le distrugă. Aceasta este o problemă pentru cercetător, deoarece scopul său este tocmai acela de a-l face să le acumuleze și apoi să le purifice și să le folosească pentru propriul său scop. Pentru a rezolva această problemă puteți:
- utilizați tulpini cu deficiență de protează
- lucrează la temperaturi scăzute, deoarece proteazele sunt fierbinți
Proteine de fuziune
Este o tehnică care vă permite să creați două proteine diferite atașate una de alta. Dar de ce ai vrea să faci proteine de fuziune?
- pentru a crește solubilitatea proteinei heteroloage
- pentru a le putea purifica mai eficient
- astfel încât să poată fi secretate
O secvență este de obicei inserată între cele două proteine care pot fi recunoscute de o anumită enzimă capabilă să taie acea secvență și să împartă cele două proteine. Această tehnică este extrem de eficientă, deoarece vă permite să purificați tot felul de proteine folosind coloane de afinitate.
Direcționarea periplasmatică
Această direcționare către proteine este extrem de utilă deoarece:
- mediul periplasmatic este extrem de oxidant și, prin urmare, favorizează plierea corectă a proteinelor
- Permite eliminarea f-met la N-terminal
- Proteinele conținute în periplasmă reprezintă doar 4% din total și, prin urmare, crește eficiența purificării
- Proteoliza este limitată în acest mediu.
