Elemente P
În biologia moleculară , ele definesc elementele P (în engleză P elements) un tip de elemente transpozabile prezente exclusiv în genomul dipterului Drosophila melanogaster . Ele au o importanță considerabilă în ingineria genetică , deoarece sunt folosite în mod profitabil de cercetători pentru a transduce ADN-ul în muște (transformare genetică) sau pentru a induce mutații controlate în structura lor genetică (mutageneză).
Caracteristici
Elementele P sunt transpozoni de clasa II și, ca atare, se pot deplasa între diferite puncte ale genomului datorită efectului unei enzime , transposaza ; elementele P complete - lung de 2907 pb - includ gena care codifică această enzimă și, prin urmare, sunt numite „autonome”. Cu toate acestea, există și elemente P non-autonome, lipsite de gena pentru transpozază și, prin urmare, incapabile să se miște, cu excepția cazului în care este prezent un al doilea element transpozabil care furnizează enzima din trans . O altă caracteristică este prezența secvențelor inversate repetate la margini, 31 bp lungime, care joacă un rol important în recunoașterea transpozazei și, prin urmare, în transpunere.
Disgenezie hibridă
Elementele P pot provoca o afecțiune patologică cunoscută sub numele de disgenie sau „ sindrom de disgeneză hibridă ” la muștele fructelor.
Pe baza prezenței sau absenței elementelor P complete în cromozomii lor, celulele Drosophila - și în consecință indivizii care le poartă - se disting în citotipul M sau P. Celulele M nu au elemente P în cromozomi, dar permit mișcarea lor; în timp ce celulele P poartă elemente P, dar nu permit mișcarea lor, deoarece exprimă o proteină represivă care împiedică transcrierea genelor pentru transpozază.
În orice caz, transpunerea are loc numai în celulele germinale și nu în cele somatice , deoarece în acestea din urmă nu există niciun eveniment de îmbinare necesar pentru formarea ARNm corect pentru transposază ( intronul dintre al doilea și al treilea exon nu este eliminat).
Disgenia hibridă apare la descendenții bărbaților P x femele M, când un spermatozoid care transportă elementele P din genomul său intră într-un ovul care îi permite să se miște. Transpunerea elementelor P în celula ovulă fertilizată determină sindromul disgenic în descendenții rezultați, caracterizat printr-o rată ridicată de mutageneză, sterilitate , niveluri ridicate de recombinare și aberație cromozomială .
Utilizări în ingineria genetică
Din anii 1980 , elementele P au fost utilizate în biologia moleculară ca instrumente de inginerie genetică în Drosophila , cu două scopuri diferite:
- transduce elemente de ADN exogen în genomul muștelor, determinându-le să pătrundă în cromozomi și să exprime (transformă)
- induce mutații în genom, provocând în general suprimarea expresiei unor gene pentru a studia funcționarea acestora (mutageneză inserțională sau knock-out de genă)
Transformare
Pentru a efectua transformarea, se utilizează elemente P private de gene pentru transpozază, prevenind astfel transpunerea lor autonomă și înlocuindu-le cu genele care urmează a fi transduse (în plus, în general, la o genă reporter care permite discriminarea indivizilor transformați). Elementul P astfel conceput este introdus într-o plasmidă și injectat într-un embrion de Drosophila în curs de dezvoltare, împreună cu o altă plasmidă care asigură în trans (la distanță) genele pentru transpozază. În acest moment, transpunerea ar trebui să aibă loc în celulele embrionului, cu inserarea elementului P în genomul individului și exprimarea genelor de interes prezente asupra acestuia, ale căror efecte vor fi vizibile în individul însuși și în descendenți.
Primul experiment de mutageneză folosind elemente P a fost realizat în 1982 de biologii Spradlin și Rubin.
Mutageneză inserțională
Mutageneza inserțională constă în utilizarea elementelor transpozabile pentru a deteriora o genă, limitând sau eliminând expresia acesteia; observarea fenotipului mutant va da indicații asupra funcției genei reprimate. Procesul este parțial similar cu cel utilizat pentru transformare: tot în acest caz, elementul P este proiectat, prin strategii de ADN recombinant , cu eliminarea genelor pentru transpozază. În locul lor, sunt inserate gene reporter, care permit identificarea indivizilor la care inserția a avut succes (genele reporter tipice din drosophila sunt cele care determină culoarea ochilor muștelor, cum ar fi albul + ), precum și un gen de antibiotic rezistența și siturile recunoscute de enzimele de restricție . Elementul P este apoi introdus într-o plasmidă și microinjectat într-un embrion Drosophila împreună cu altul care transportă genele pentru transpozază. Elementul P se va integra aleatoriu în genomul individului, dar de obicei într-o genă transcrisă activ (ca zonă în care cromatina este eliberată și, prin urmare, mai ușor accesibilă), reprimând sau oprind activitatea sa. Fenotipul rezultat poate fi observat la individ sau la descendenții săi (recunoscut prin expresia genei raportoare) și poate oferi indicații cu privire la funcția genei mutante.
Bibliografie
- Leland Hartwell și colab. 2004. Genetica - De la gene la genomi Ediția a II-a. McGraw-Hill
- Engels, WR P Elements in Drosophila
