NASBA
NASBA este o metodă de biologie moleculară pentru studiul secvențelor de acid nucleic și în special a ARN-ului (și, numai într-un singur caz, ADN-ului ). Permite multiplicarea (amplificarea) secvenței studiate, astfel încât să poată fi apoi detectată și cuantificată. Acronimul înseamnă acronimul în limba engleză "Nucleic Acid Sequence Based Amplification", sau "amplificare bazată pe o secvență de acizi nucleici".
NASBA a fost dezvoltat de J. Compton în 1991, care l-a definit ca „o tehnologie bazată pe primer care poate fi utilizată pentru amplificarea continuă a acizilor nucleici într-un singur amestec izotermic ” [1] . După mai mult de cinci ani, apare NASBA în timp real, capabil să măsoare numărul de copii ale acidului nucleic în timpul reacției.
Operațiune
Pe scurt, tehnica funcționează după cum urmează:
- secvența de ARN care urmează să fie amplificată este inserată în amestecul de reacție, unde primul primer se atașează la locul complementar la capătul 3 'al ARN;
- o transcriptază inversă sintetizează ADN complementar (ADNc) pornind de la primer;
- enzima ribonuclează H distruge secvența ARN inițială (RNaza H distruge numai hibrizii ARN-ADN, nu ARN monocatenar);
- al doilea primer se leagă de capătul 5 'al catenei ADN;
- ARN polimeraza T7 se leagă de al doilea primer și produce un ARN complementar care poate fi utilizat în etapa 1, închizând astfel ciclul de reacție.
La încheierea ciclurilor, se adaugă sonde de acid nucleic care hibridizează la copiile amplificate. Sondele legate, deoarece sunt cuantificabile, permit detectarea numărului de copii.
În NASBA în timp real, sunt utilizate sonde fluorescente care, odată hibridizate, sunt detectate de un fluorometru .
Aplicații
Tehnica este o alternativă la metoda RT-PCR în multe ocazii [2] , mai ales când secvența de pornire este ARN. Comparativ cu PCR, NASBA permite:
- eficacitate crescută a amplificării ARN într-un amestec bogat în ADN;
- condiții de lucru izoterme (de obicei 41 ° C), pentru a nu necesita cicluri de încălzire și răcire;
- testare mai rapidă;
- detectarea unor cantități mai mici de acid nucleic.
NASBA a fost introdus în curând în diagnosticul medical, unde primele aplicații implicau diagnosticul și cuantificarea rapidă a HIV-1 în ser [3] .
De-a lungul timpului, domeniul de aplicare s-a extins la teste rapide de diagnosticare pentru mulți viruși patogeni cu genomi monocatenari de ARN (cum ar fi Gripa A [4] , virusul febrei aftoase [5] și Coronavirus asociat cu sindromul respirator acut sever (SARS) ) [6] .
Notă
- ^(EN) Compton J. Amplificare pe bază de secvență a acidului nucleic. Natură. 1991; 350 (6313): 91-2.
- ^(EN) Schneider și colab. Amplificarea în timp real pe bază de secvență a acidului nucleic este mai convenabilă decât PCR în timp real pentru cuantificarea Plasmodium falciparum. J Clin Microbiol. 2005; 43 (1): 402-5
- ^(EN) Kievits și colab. Amplificarea enzimatică izotermică NASBA in vitro a acidului nucleic optimizată pentru diagnosticul infecției cu HIV-1. Metode J Virol. 1991; 35 (3): 273-86.
- ^(EN) Collins și colab. Detectarea subtipului H5 de gripă aviară extrem de patogenă și patogenă scăzută (descendență eurasiatică) utilizând NASBA. Metode J Virol. 2002; 103 (2): 213-25.
- ^(EN) Collins și colab. O metodă de detectare a serotipurilor majore ale virusului febrei aftoase. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 297 (2): 267-74.
- ^(EN) Keightley și colab. Detecția NASBA în timp real a coronavirusului asociat SARS și compararea cu transcrierea inversă în timp real-PCR. J Med Virol. 2005; 77 (4): 602-8.
linkuri externe
- ( RO ) Explicația tehnologiei NASBA , pe ibi.cc. Adus la 14 iulie 2009 (arhivat din original la 11 decembrie 2008) .
