Plasmidă recombinantă
Această intrare sau secțiune despre genetică nu citează sursele necesare sau cei prezenți sunt insuficienți . |
Plasmidele sunt molecule de ADN circular dublu catenar auto-replicate, deoarece se duplică independent de genomul bacteriei gazdă și rămân ca entități extracromozomale, adică separate fizic de cromozomul bacterian. În general, dimensiunea lor este cuprinsă între 1kb și peste 500kb și sunt prezenți în celula gazdă cu un număr de copii variind de la 1 la 100, iar pe baza numărului de copii pe care le prezintă în celula gazdă pot fi clasificați în plasmide cu o numărul de copii , care variază între 10 și 100 de exemplare, și plasmidele cu număr mic de copii (1-4). Acestea se găsesc în aproape toate genurile bacteriene și pot conferi un anumit fenotip oferind o caracteristică suplimentară: un exemplu este factorul de fertilitate F care transportă informațiile necesare pentru a se transfera de la o celulă la alta; alte plasmide, cunoscute sub numele de degradative, poartă gene pentru metabolismul unor substanțe, în timp ce plasmidele R poartă gene pentru rezistența la antibiotice, în timp ce altele, cunoscute sub numele de plasmide criptice, nu au gene codificatoare evidente.
Plasmidele recombinate (Fig. 1.1) sunt vectori obținuți prin ingineria plasmidelor naturale. Această manipulare este necesară pentru a putea fi exploatate în domeniul tehnologiei ADN-ului recombinant, în special ca vectori de clonare și vectori de expresie genică. Există numeroase tipuri de plasmide recombinate, dar toate au următoarele caracteristici:
- dimensiune mică (<15 kbp), pentru a crește randamentul de transfer al ADN-ului exogen: cu cât sunt mai mari, cu atât sunt mai instabile;
- prezența secvenței ori , originea replicării : această secvență este necesară pentru a începe duplicarea autonomă a plasmidei în interiorul celulei gazdă; poate fi, de asemenea, prezent în duplicat dacă plasmida recombinantă se face mai întâi să se extindă într-o celulă bacteriană și apoi într-o celulă eucariotă (cele două aurii au o secvență diferită). Această secvență este fundamentală deoarece lipsa sa împiedică replicarea plasmidei în interiorul celulei gazdă;
- markeri genetici sau gene marker selectabile : aceste secvențe sunt necesare pentru a selecta celulele care au încorporat plasmida dintre cele care nu; în cele mai simple cazuri această secvență poate fi o genă pentru rezistența la un antibiotic precum ampicilina, în alte cazuri poate fi un fragment al operonului Lac;
- sit de clonare multiplă sau polilinker: această secvență conține site-uri de recunoaștere unice pentru endonucleaze de restricție în care să se introducă ADN-ul exogen.
Plasmidele procariote
Pentru a obține o plasmidă recombinantă se efectuează o procedură standard dezvoltată în mai multe faze:
- ADN-ul genomic care conține gena de interesul nostru este digerat cu o endonuclează de restricție, care recunoaște și taie firele în corespondență cu secvențe de nucleotide specifice (situri de restricție);
- ulterior, plasmida este digerată cu aceeași enzimă de restricție utilizată pentru ADN-ul genomic și tratată cu fosfatază alcalină pentru a preveni reciclarea acesteia;
- plasmida și gena de interes sunt unite împreună în prezența ADN-ligazei T4 care creează o legătură fosfodiesterică între capetele compatibile generând un heteroduplex și deci o plasmidă recombinantă;
- plasmida recombinantă este introdusă în celulele bacteriene în prezența clorurii de calciu la temperaturi ridicate (42 ° C): procesul duce la transformarea celulelor bacteriene.
Tehnici de transformare bacteriană
Există mai multe tehnici pentru transformarea genetică a procariotelor cu o eficiență diferită (figura 2.0):
- transformare prin clorură de calciu (CaCl2): celulele sunt plasate în prezența acestei substanțe și amestecul care conține plasmidele, toate sunt incubate la -80 ° C pentru a face celulele competente.
(Fig.2.0) Transformarea procariotă - electroporare: o tehnică care constă în expunerea celulelor la câmpuri electrice pulsatorii, care destabilizează membrana E. coli și induc formarea de pori tranzitorii cu diametrul de câțiva nanometri, prin care moleculele de ADN prezente în exterior pot pătrunde în celule; la cultura E. coli se adaugă un amestec de 50 microlitri de construct ADN, se impune un impuls de aproximativ 25 microfarade timp de 4,6 milisecunde; randamentul transformării acestei tehnici este ridicat de 10 9 celule pe microgramă;
- conjugare: conjugarea naturală a ADN-ului plasmidic de la o celulă donatoare la un receptor este exploatată pentru a transfera constructele ADN-ului inserat de plasmidă într-o celulă care nu este ușor de transformat; trei tulpini sunt folosite pentru realizarea acesteia: celulă cu plasmidă conjugativă, celulă cu vectorul de clonare a plasmidelor, celulă primitoare.
pBR322
Din punct de vedere istoric, cele mai utilizate plasmide în tehnologia ADN-ului recombinant sunt pUC18 și pBR322. Progenitorul vectorilor de plasmidă artificială este pBR322 . Abrevierea indică: p = plasmidă BR = cercetători care au creat plasmida în 1977 (Bolivar și Rodriguez) 322 = numărul plasmidei din colecția lor de ADN. Are mai multe caracteristici care îl fac util ca vector de clonare:
- Este relativ mic ( 4361 pb ).
- Rămâne stabil în gazda sa ( Escherichia coli ) cu un număr relativ mare de copii pe celulă (20-30).
- Poate fi amplificat la un număr mare (1000-3000 de copii pe celulă, aproximativ 40% din genom) prin adăugarea de cloramfenicol, care inhibă sinteza proteinelor.
- Este ușor de izolat într-o formă supraînfășurată prin diverse tehnici.
- Este posibil să introduceți o cantitate de ADN care să nu depășească 10 Kb, ceea ce l-ar face instabil.
- Există site-uri unice pentru mai multe enzime de restricție, cum ar fi PstI, SalI, EcoRI, HindIII, BamHI și multe altele. Situl EcoRI este situat între genele care codifică rezistența la antibiotice prezente pe plasmidă. Prezența unui site unic pentru cel puțin o enzimă de restricție este importantă, astfel încât tratamentul cu acea enzimă liniază plasmida, fără a o fragmenta.
- Există doi markeri de rezistență la antibiotice ( ampicilină și tetraciclină ) care permit selecția ușoară a celulelor gazdă care conțin plasmida.
- Poate fi ușor introdus în celule prin transformare. Site-urile implicate în acest proces sunt BamHI, localizat în gena pentru rezistența la tetraciclină și PstI, situat în loc în interiorul celei pentru rezistența la ampicilină. Dacă un fragment de ADN exogen este inserat într-unul dintre aceste site-uri, rezistența la antibiotic se pierde printr-un fenomen numit inactivare inserțională. Această strategie este utilizată pentru a identifica prezența ADN-ului exogen în plasmidă. Prin urmare, dacă pBR322 este digerat cu BamHI, legat de ADN-ul de inserat și ulterior clonele bacteriene transformate sunt izolate, clonele selectate care sunt rezistente atât la ampicilină, cât și la tetraciclină sunt cele care nu au inserat ADN-ul exogen (plasmida încorporată în celula este vectorul care s-a închis fără introducerea de ADN exogen). În schimb, acele celule care sunt încă rezistente la ampicilină, dar sensibile la tetraciclină, conțin plasmida în care a intrat ADN-ul exogen. Deoarece rezistența la aceste două antibiotice poate fi evaluată pe plăci de agar, bacteriile care conțin clona dorită pot fi ușor identificate și celulele care nu conțin plasmida pot fi eliminate.
pUC19
Plasmida recombinantă creată pentru a compensa selecția laborioasă necesară pentru pBR322, se caracterizează prin:
- au o lungime de aproximativ 2686 bp în care este posibil să se introducă un fragment de ADN exogen de maxim 10kb;
- secvența ori, originea replicării care funcționează în E. Coli (aceeași prezentă în pBR322);
- gena de rezistență la ampicilină;
- gena lacZ 'care codifică o parte a enzimei β-galactozidazei, partea rămasă constă din lacα prezentă ca o genă cromozomială;
- secvență de clonare multiplă (MCS) sau Polylinker, plasată chiar în aval de lacZ ';
- gena lacI care codifică o proteină represor lacZ '.
Cum este inserat segmentul ADN în vectorul plasmidei pUC19:
- inițial, plasmida a fost tăiată cu enzima de restricție
- aceeași enzimă de restricție taie și ADN-ul care trebuie clonat
- se efectuează amestecarea fragmentelor de ADN tăiat cu vectorul plasmidic tăiat
- ADN ligaza sudează fragmentele ADN cu vectorul plasmidă
- ca ultim pas, inserarea moleculelor de ADN recombinant în celulele E. coli are loc prin transformare
Strategia utilizării acestei plasmide este de a crește celulele transformate într-un mediu care conține:
- ampicilină, pentru a selecta numai celulele care poartă plasmida recombinantă;
- IPTG (izopropil-β-D-tiogalactopiranozidă), represor al genei lacI;
- X-gal (5 brom-4-clor-3-indoyl-β-D-galactopiranozidă), produs care suferă hidroliză prin β-galactozidază;
dacă în E. coli avem inserția plasmidei pUC19 lipsită de ADN exogen, se obțin colonii albastru-albastru, deoarece IPTG a inhibat lacI permițând lacZ 'să fie tradus și produs pentru a forma β-galactozidază cu scindarea consecventă a X-gal; dacă ADN-ul exogen este inserat în situl de clonare multiplă, poziționat în gena lacZ ', se obține o modificare și se obține o distrugere a grilei de citire lacZ' și, în consecință, nu există formarea β-galactozidazei și scindarea X - gal, deci coloniile de E. coli sunt albe. Coloniile care trebuie selectate sunt cele de culoare albă, adică cele care au plasmida care conține fragmentul de ADN.
Plasmidele eucariote
Sistemele de expresie procariotă sunt în general utile pentru producerea proteinelor heteroloage din ADNc eucariote clonate. În ciuda acestui fapt, în unele cazuri, proteinele eucariote sintetizate de aceste celule sunt lipsite de activitate biologică sau sunt contaminate de compuși toxici de origine bacteriană. Pentru a preveni aceste dezavantaje, în special atunci când proteinele sunt utilizate în scopuri terapeutice sau clinice, au fost dezvoltate sisteme de expresie eucariote. De fapt, acestea din urmă, spre deosebire de celulele procariote, sunt mai potrivite pentru producerea proteinelor care primesc modificări post-translaționale pentru funcționarea lor corectă. Bacteriile, fiind celule simple, sunt cele mai puțin susceptibile de a efectua modificări chimice particulare, cum ar fi glicozilarea, acetilarea, fosforilarea, palmitarea, miristilarea și carboxilarea. Prin urmare, recurgând la aceste sisteme de expresie eucariote, proteina este biologic activă și stabilă în timp. În general, vectorii de expresie eucariotă au același tip de caracteristici ca procariotele lor corespunzătoare:
- o origine a replicării ( ori ) dacă vectorul trebuie să se replice autonom în interiorul celulei ca entitate extracromozomală. Celulele eucariote au două aurii , unul procariot care funcționează în E. coli și un aur care funcționează în celula eucariotă; acest lucru se face pentru a testa eficiența vectorului; dacă funcționează în E. coli poate fi ulterior introdus într-o celulă eucariotă. Pe de altă parte, dacă vectorul urmează să fie conjugat cu ADN-ul cromozomial al gazdei (vector integrativ), atunci acesta va purta o secvență complementară unui segment al ADN-ului cromozomal (situl de integrare cromozomială); această legătură apare prin dublă încrucișare;
- o genă marker eucariotă selectabilă ;
- o secvență de promotor eucariot;
- semne de oprire ;
- secvență care semnalează poliadenilarea ARNm.
Dintre sistemele de expresie eucariote unicelulare, drojdia Saccharomyces cerevisiae este cea mai utilizată istoric. Este un microorganism care crește ușor în condiții de laborator, cu timpi de dublare medii de aproximativ 1-2 ore, genetica sa este bine cunoscută și este un organism sigur (GRAS). În ultimele decenii, alte specii în afară de S. cerevisiae au găsit o utilizare tot mai mare pentru exprimarea proteinelor, în special drojdii metanoltrofice (adică capabile să utilizeze metanolul ca sursă de carbon) și printre acestea se remarcă Pichia pastoris . Avantajul acestei specii constă în capacitatea de a crește la densități celulare ridicate pe un mediu de cultură ieftin și cu niveluri de expresie ale proteinei de interes care pot ajunge la grame / litru. Printre proteinele produse din sistemele de expresie a drojdiei se numără antigenele virale și bacteriene (virusurile hepatitei B și C), citokinele și factorii de creștere umană (TNF și EGF), agenții trombolitici (streptokinaza) și o nouă generație de insulină cu acțiune rapidă (NovoLog).
Drojdiile sunt transfectate folosind trei tehnici:
- ADN-ul exogen este introdus în interiorul celulei după eliminarea peretelui celular prin cale enzimatică sau chimică;
- tratarea celulelor cu acetat de litiu;
- prin intermediul tehnicii de electroporare.
Printre cele mai complexe sisteme de expresie se numără celulele mamiferelor . Cu toate acestea, acestea se caracterizează prin randamente mici, timp de așteptare lung și sunt foarte scumpe; prin urmare, acestea sunt utilizate numai în cazuri speciale, cum ar fi pentru producerea de proteine de origine umană (de exemplu, citocromi P450). ADNc care codifică proteina de interes trebuie clonat anterior într-un vector de expresie și apoi transferat (transfectat) în celula eucariotă sau în genomul unui virus care este apoi utilizat pentru a infecta celulele.
Transfecția celulelor animale are loc prin:
- electroporare;
- prin incubarea celulelor cu ADN coprecipitat cu fosfat de calciu sau cu DEAE-dextran.
Bibliografie
- Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, BILETEHNOLOGIA MOLECULARĂ principiile și aplicațiile ADN-ului recombinant, 1999 , Bologna, Zanichelli.
