Reacție în lanț a polimerazei

Ciclorul termic efectuează automat modificările de temperatură necesare pentru PCR

Prototipul termociclatorului care conține software-ul aplicației integrat în hardware ( 1986 )

Reacția în lanț a polimerazei (în engleză : polymerase chain reaction ), cunoscută în mod obișnuit prin acronimul PCR , este o tehnică de biologie moleculară care permite multiplicarea ( amplificarea ) fragmentelor de acid nucleic din care sunt cunoscute secvențele de nucleotide inițiale și terminale. Amplificarea prin PCR permite obținerea foarte rapidă a cantității de material genetic necesar pentru aplicațiile ulterioare in vitro .

Această metodă a fost concepută în 1983 ^[1] de Kary B. Mullis care a obținut, pentru aceasta, Premiul Nobel pentru chimie ( 1993 ). ^[2]

Mecanismul de funcționare

Diagrama de fază a unui PCR:
1. Denaturare
2. Recuplare
3. Alungirea
4. Sfârșitul ciclului

PCR in vitro reconstituie o etapă specifică a duplicării celulare: reconstituirea ( sinteza ) unui segment de ADN „complet” (dublu-catenar) pornind de la un catenă monocatenar. Catenă lipsă este reconstruită pornind de la o serie de nucleotide („blocurile elementare” elementare care alcătuiesc acizii nucleici) care sunt dispuse în secvența corectă, complementară cu cea a ADN-ului afectat.

Acest proces este realizat în natură de enzime numite ADN-polimeraze , care sunt capabile să sintetizeze progresiv o nouă catenă de ADN în următoarele condiții:

nucleotidele care urmează să fie polimerizate trebuie să fie disponibile sub formă de dezoxiribonucleozide trifosfați ( dNTP );
ADN-ul trebuie denaturat , adică cele două spirale care alcătuiesc firele trebuie deja separate;
segmentul de reconstituit poate fi prelungit doar, adică nu este posibilă sintetizarea unei noi suvite începând de la zero;
în plus, trebuie respectate condițiile adecvate de temperatură , pH etc.

Prin urmare, este posibilă reconstituirea condițiilor care duc la formarea de noi segmente de ADN, prin punerea în soluție:

chiar și o cantitate mică din segmentul ADN pe care doriți să îl reproduceți;
o cantitate adecvată de nucleotide libere pentru a constitui noile filamente;
"primeri" adecvați, numiți primeri , constând din secvențe scurte de ADN ( oligonucleotide ) complementare la capetele 5 'și 3' ale celor două filamente ale segmentului care trebuie reprodus;
o ADN polimerază termorezistentă (nu trebuie să provină din același organism al cărui ADN urmează să fie reprodus);
un tampon care servește la menținerea pH-ului potrivit pentru reacție stabil;
alte elemente de susținere (de exemplu, ioni de magneziu ) esențiale pentru funcționarea corectă a ADN polimerazei;

Pentru a începe reacția polimerazei (faza de extindere a filamentului începând de la primerul 5 ') este mai întâi necesar să se prevadă separarea firelor de ADN (faza de denaturare ), apoi să se creeze legătura dintre primeri și regiunile lor complementare ale filamentele ADN-ului denaturat (faza de recoacere ). Cu toate acestea, acest proces este incompatibil cu ADN polimeraza umană, care este distrusă la temperaturile necesare denaturării (96-99 ° C).

Pentru a depăși acest dezavantaj, se utilizează polimerazele aparținând organismelor termofile care nu sunt inactivate de temperaturi ridicate, de exemplu polimeraza Taq provenită de la bacteria termofilă Thermus aquaticus . Acest lucru permite efectuarea mai multor cicluri PCR în ordine, în care ADN-ul sintetizat în fazele anterioare este de asemenea duplicat, obținându-se o reacție în lanț care permite o multiplicare extrem de rapidă a materialului genetic de interes.

Schema unui ciclu PCR

Soluția de ADN care trebuie reprodusă, deoxiribonucleotide trifosfați, ioni de magneziu, primer și TAQ polimerază este adusă la o temperatură între 94 și 99 ° C. În consecință, ne aflăm într-o situație în care dubla helix ADN este complet clivată și cele două fire din care este compus sunt libere (faza de denaturare ).
Ulterior, temperatura este redusă la aproximativ 40-55 ° C pentru a permite legarea primerilor de regiunile lor complementare ale catenei ADN denaturate (faza de recoacere ).
În cele din urmă, temperatura este crescută până la 65-72 ° C pentru a maximiza acțiunea polimerazei TAQ care determină o alungire a primerilor legați, utilizând unicul fir de ADN ca șablon (faza de extensie ).

Ciclul descris se repetă în general de aproximativ 30-40 de ori. În general, 50 de cicluri nu sunt depășite întrucât la un moment dat cantitatea de ADN obținut ajunge pe un platou . Acest lucru se întâmplă, de exemplu, din cauza lipsei de oligonucleotide utilizate ca primer sau a scăderii dNTP-urilor. De asemenea, trebuie considerat că orice material genomic contaminant ar putea fi, de asemenea, amplificat excesiv.

Eficienţă

În teorie, fiecare ciclu ar trebui să dubleze cantitatea de ADN; acest lucru, însă, nu se realizează. Pentru a avea o estimare suficient de fiabilă a numărului de catene de ADN obținute ulterior $n$ ${\ displaystyle n}$ $n$ cicluri puteți utiliza formula: ^[3]

$Y_{n}=A\cdot (1+E)^{n}$ ${\ displaystyle Y_ {n} = A \ cdot (1 + E) ^ {n}}$ $Y_ {n} = A \ cdot (1 + E) ^ {n}$

unde este:

$Y_{n}$ ${\ displaystyle Y_ {n}}$ $Y_ {n}$ = ADN produs ulterior $n$ ${\ displaystyle n}$ $n$ cicluri
$LA$ ${\ displaystyle A}$ $LA$ = cantitatea inițială de ADN prezent
$n$ ${\ displaystyle n}$ $n$ = numărul de cicluri PCR efectuate
$ȘI$ ${\ displaystyle E}$ $ȘI$ = eficiența amplificării (de obicei între 0,7 și 0,8)

Configurarea unui PCR

Tuburi PCR, fiecare conținând 100 pl de amestec de reacție

Alegerea țintei

Alegerea țintei genetice care urmează să fie amplificată prin PCR depinde de ceea ce vă interesează să obțineți și din acest motiv sunt utilizate diferite strategii, cum ar fi, de exemplu:

în cazul bolilor genetice sau tumorale, gena responsabilă de aceste stări patologice este amplificată (evident că gena în cauză trebuie să fi fost deja recunoscută),
în cazul bolilor infecțioase , pot fi amplificate genele microorganismului în cauză, care codifică funcțiile vitale esențiale sau factorii de virulență .

Ținta care trebuie amplificată poate fi, de asemenea, o moleculă de ARN (ca, de exemplu, în cazul unor viruși) care trebuie, ca prim pas, să fie supusă unei reacții de retranscriere (vezi și RT-PCR ).

Cantitatea de material vizat

O cantitate mică de țintă poate fi utilizată pentru a efectua o PCR, deoarece sensibilitatea reacției este foarte mare. S-a demonstrat că 100 ng de ADN genomic sunt suficiente pentru a identifica o genă țintă care este prezentă într-o singură copie. Cu toate acestea, prezența unei cantități reduse de țintă crește probabilitatea ca secvențele nespecifice să fie amplificate.
O cantitate prea mare de ADN, pe de altă parte, poate reduce eficiența amplificării datorită prezenței a prea mulți contaminanți și poate face dificilă evaluarea randamentului reacției în timpul proceselor de optimizare a parametrilor individuali pentru a încerca să configurați tot PCR-ul.
În timpul fazelor de pregătire a unui PCR ar fi bine, pentru a evita problemele recent raportate, pentru a încerca să optimizăm cantitatea de ADN utilizat (deși acest lucru nu este întotdeauna posibil), trimițând o serie de reacții de amplificare în care toți parametrii sunt fixați cu excepția cantității de ADN care este utilizat în doze scalare.
Cu toate acestea, pentru a face acest lucru, este necesar să se poată evalua cantitatea de ADN obținută în timpul procesului de extracție și aceasta poate fi obținută printr-o citire spectrofotometrică a unei alicote a extractului în care se măsoară absorbanța la 260 nm, și luând în considerare faptul că o valoare de absorbție de 1 cu o cale de 1 cm corespunde la 50 pg / ml ADN dublu catenar și 40 pg / ml ADN monocatenar sau ARN. Mai mult, prin efectuarea unei citiri la o lungime de undă de 280 nm (vârf de absorbanță al proteinelor , principalul contaminant al extractelor) și efectuarea raportului dintre absorbantele respective la 260 și 280 nm este posibil să se obțină o estimare a purității a ADN-ului obținut (în general în preparate de ADN pur sau ARN acest raport este de 1,8 și respectiv 2,0).
Citirea la 230 nm, pe de altă parte, reflectă prezența contaminanților precum: fenol , compuși aromatici, peptide și carbohidrați . Raportul dintre absorbanță la 260 nm și cel la 230 nm permite evidențierea contaminării de către acești agenți (în preparatele pure este de 2,2).
Preparatele în care raporturile indicate mai sus diferă semnificativ de cele ale preparatelor pure sunt un indiciu de contaminare și acest lucru face ca estimarea concentrației de ADN obținută să fie mai puțin precisă.
Alți factori care pot afecta eficiența amplificării sunt: prezența ADN-ului circular și greutatea moleculară a acestuia. Într-adevăr, eficiența amplificării este ușor mai mică în moleculele ADN circulare sau în cele care au o greutate moleculară prea mare, astfel încât, în aceste cazuri, este recomandabil să se utilizeze enzime de restricție specifice care să permită, respectiv, să se liniarizeze materialul genomic sau să se reducă în fragmente mai mici.

Comenzile

Pregătirea controalelor de calitate adecvate permite evaluarea sensibilității și specificității metodei, precum și evidențierea prezenței falsurilor pozitive sau a falselor negative . Comenzile care trebuie utilizate sunt:

controlul pozitiv,
controlul negativ.

Controlul pozitiv constă dintr-un eșantion în care este conținută secvența țintă. Acest control nu ar trebui să conțină un număr prea mare de copii ale secvenței țintă (de obicei între 10 ⁵ și 10 ⁶ ). Aceasta pentru a evita crearea de aerosoli periculoși care pot contamina alte probe sau pentru a subestima posibilele scăderi ale sensibilității reacției cu producerea de negative negative.
Controlul negativ constă dintr-un eșantion în care secvența țintă lipsește. Este folosit pentru a evidenția orice contaminare care s-ar putea referi atât la extragerea materialului genomic, cât și la prepararea PCR.

Grundurile

Alegerea primerilor de utilizat este un aspect esențial pentru succesul PCR. De fapt, trebuie să fie capabili să se hibridizeze într-un mod specific și eficient cu secvența de interes, lăsându-le în afara celor nespecifice. Tipul de grund care trebuie utilizat variază în funcție de scopul PCR.
În cazul bolilor infecțioase, este convenabil să se utilizeze grunduri care sunt specifice speciilor sau care pot distinge în mod eficient între tulpini patogene și nepatogene.
În schimb, pot fi utilizate două strategii pentru diagnosticarea patologiilor genetice: primeri care sunt complementari regiunilor adiacente aceleia în care se găsește mutația care trebuie identificată sau primeri în care unul dintre cei doi este complementar secvenței mutate. În acest din urmă caz, în absența mutației, nu va exista niciun produs de amplificare. Deoarece complementaritatea primerilor în raport cu secvențele țintă poate să nu fie absolută, este posibil să se recurgă la utilizarea primerilor care conțin unele nucleotide necomplementare (pentru a crea, de exemplu, site-uri de clivaj pentru enzimele de restricție) sau primeri degenerați ( adică amestecuri de oligonucleotide care variază între ele datorită prezenței unor baze diferite în puncte specifice). Acestea din urmă fac posibilă identificarea genelor a căror secvență proteică este cunoscută sau gene omoloage între diferite specii.
La configurarea unui PCR, distanța dintre cei doi grunduri este destul de flexibilă și poate varia de la 100 la 10.000 de perechi de baze (deși, în realitate, eficiența amplificării scade atunci când se depășesc 3000 de perechi de baze). Pentru a încerca să depășească această problemă, au fost construite variante ale ADN polimerazei fără activitate de exonuclează (variind de la 5 'la 3').
Lungimea unui grund este în general între 20 și 30 de perechi de baze și nu trebuie să fie mai mică de 16 (pentru a nu compromite specificitatea procesului).
Datorită bazelor de date și publicațiilor științifice, secvențele de ADN sau ARN necesare pentru proiectarea primerilor care vor fi utilizați în PCR devin din ce în ce mai disponibile.
Odată ce secvența de interes a fost obținută, este necesar să verificați dacă în restul genomului nu există secvențe omoloage care ar putea duce la producerea de fals pozitivi și apoi puteți începe să proiectați primerii ținând cont de câteva precauții:

conținutul GC ar trebui să fie între 45 și 50%;
grundurile nu trebuie să conțină secvențe complementare sau secvențe repetate inversate pentru a evita agregatele de grund (numite dimeri de grund ) sau structurile de ac de păr.

Concentrația cu care primerii sunt utilizați în mod obișnuit este de aproximativ 1 mM și se crede că o astfel de cantitate este suficientă pentru cel puțin 30 de cicluri de amplificare. O concentrație prea mare a primerului ar putea duce la amplificarea secvențelor nespecifice, în timp ce, dimpotrivă, prezența prea mică a primerului face PCR ineficientă. Prin urmare, pentru a configura un PCR, va fi necesar să se optimizeze concentrația primerilor , prin intermediul diluțiilor scalare.

Magneziu

Concentrația de magneziu este, fără îndoială, cel mai critic factor din toate PCR. Acest parametru trebuie să facă obiectul unei proceduri de optimizare atentă, deoarece poate varia chiar dacă sunt folosiți grunduri diferite pentru a amplifica aceeași regiune ADN. Prezența magneziului condiționează activitatea polimerazei, hibridizarea primerilor și crește temperatura la care sablonul ADN este denaturat.
Având în vedere importanța mare a magneziului, trebuie avut grijă ca în soluția de reacție să nu existe o cantitate excesivă de agenți chelatori (de exemplu: EDTA ) sau grupuri încărcate negativ (de exemplu: grupări fosfat), deoarece ambele pot captura magneziul prezent, făcându-l indisponibil. . În consecință, pentru a configura o PCR, este bine să configurați diferite amestecuri de reacție care conțin cantități progresive scalare de magneziu variind de la un minim de 0,05 mM până la un maxim de 5 mM (cel mai adesea se folosește 1,5 mM magneziu).

Nucleotidele

În general, nucleotidele sunt utilizate la o concentrație de 200 uM fiecare. O creștere a acestei concentrații nu duce la o creștere a eficienței reacției, deoarece grupările fosfat încărcate negativ se pot lega de magneziul amestecului, făcându-l mai puțin disponibil. Nucleotidele, în concentrații mai mari de 200 µM, pot crește procentul de eroare al polimerazei sau chiar o pot inhiba dacă sunt prezente în concentrație milimolară.

Enzima

În primele studii PCR, a fost utilizat un fragment de ADN polimerază Escherichia coli (numit fragment Klenow) obținut prin digestie enzimatică. Temperaturile necesare pentru denaturarea ADN-ului, din păcate, au dezactivat această enzimă care trebuia reintrodusă în tub după fiecare etapă de denaturare. Introducerea ulterioară a polimerazei Taq, o polimerază termostabilă , a făcut posibilă rezolvarea acestei probleme destul de plictisitoare.
Taq polimeraza a permis, de asemenea, o îmbunătățire a specificității PCR, deoarece a permis utilizarea temperaturilor de recoacere și alungire mai mari decât cele posibile cu fragmentul Klenow, ceea ce face reacția mai strictă. Într-adevăr, polimeraza Taq are un vârf de activitate enzimatică în jurul valorii de 75-80 ° C și, de asemenea, permite amplificarea fragmentelor mai lungi de 400 b (limita fragmentului Klenow), până la maximum 10 Kb.
Spre deosebire de alte polimeraze, Taq polimeraza prezintă activitate de exonuclează 5'-3 ', dar nu în direcția 3'-5'. În direcția 3'-5 ', polimerazelor, inclusiv fragmentului Klenow, li se permite să corecteze orice erori (citirea dovezilor) din cauza unei încorporări incorecte a nucleotidelor. Acest lucru face ca Taq polimeraza să aibă o rată de eroare de 2 x $10^{-5}$ ${\ displaystyle 10 ^ {- 5}}$ $10 ^ {{- 5}}$ nucleotide, valoare care în orice caz poate varia prin modularea adecvată a unor parametri precum:

concentrația de nucleotide,
concentrația de magneziu,
"temperatură de topire
temperatura de recoacere .

Din fericire, această rată de eroare este irelevantă pentru majoritatea aplicațiilor ulterioare, cum ar fi secvențierea sau utilizarea sondelor specifice.
Cu toate acestea, cercetarea a vizat găsirea altor polimeraze cu o frecvență de eroare mai mică și cu o rezistență mai mare la temperaturi ridicate. Acest lucru a dus la comercializarea altor enzime, precum cele obținute prin purificare de la Thermococcus Litoralis , Pyrococcus furiosus sau Thermotoga maritima . Primul, de fapt, asociază o termorezistență ridicată cu o fidelitate mai mare în sinteza filamentului complementar, în timp ce celelalte prezintă o interesantă activitate de corectură.
Fragmentul Stoffel este o ADN polimerază obținută prin eliminarea celor 289 aminoacizi din porțiunea N-terminală a polimerazei Taq. Acest lucru face ca enzima rezultată să fie lipsită de activitate de exonuclează 5'-3 'și să aibă o rezistență mai mare la temperaturi ridicate (de fapt are un timp de înjumătățire de aproximativ 20 de minute la 97,5 ° C). O astfel de caracteristică permite utilizarea temperaturilor de denaturare mai mari decât de obicei și ușurința în sinteza fragmentelor bogate în guanină și citozină care au o structură secundară oarecum elaborată. O altă caracteristică favorabilă este că are o activitate optimă într-un interval larg de concentrație de magneziu, între 2 și 10 mM. Acest lucru poate facilita utilizarea acestuia în cazul PCR care amplifică mai mult de o țintă (multiplex PCR).
ADN polimeraza, extrasă din Thermus aquaticus și produsă ulterior recombinant, are, pe lângă acțiunea clasică, o activitate de transcriptază inversă (ADN polimerază dependentă de ARN) care are loc în prezența clorurii de mangan la o temperatură de aproximativ 60 ° C. ADN-polimeraza ADN dependentă este activată cu adăugarea de clorură de magneziu care chelează manganul . Această enzimă pare, de asemenea, să reziste bine oricărei componente sanguine capabile să inhibe polimeraza Taq, deci găsește aplicabilitate în domeniul diagnosticului de laborator în care este necesară utilizarea unei ținte ARN.
AmpliTaq Gold ADN polimeraza este, de asemenea, disponibilă pe piață, care poate fi activată treptat după expunerea la 95 ° C timp de 10 minute. Această activare, care se încadrează în conceptul de " pornire la cald " PCR, permite o creștere a sensibilității și specificității reacției. În cele din urmă, este foarte util în PCR multiplex, deoarece reduce legarea nespecifică a primerilor și formarea dimerilor.
Cantitatea de enzimă care trebuie utilizată poate fi, de asemenea, un factor limitativ în precizia PCR, deoarece concentrația este prea mică randamentul produsului amplificat este slab, în timp ce dacă este prea mare, pot fi generate produse nespecifice. Cel mai adesea se utilizează o cantitate de enzimă care variază între 1 și 5 unități la 100 pl. În general, cantități mai mari de enzimă sunt utilizate pentru a amplifica materialul genetic complex, cum ar fi genomica .

Parametrii care trebuie adoptați

În etapa de denaturare, după cum sa menționat anterior, trebuie să aibă loc separarea completă a celor două catene de ADN. Acesta este un moment important, deoarece denaturarea incompletă poate pune în pericol eficiența amplificării. Denaturarea are loc destul de repede, dar trebuie să se asigure că temperatura atinsă este omogenă în tot tubul de reacție. De cele mai multe ori temperatura utilizată este de 94 ° C timp de 30-60 de secunde, dar trebuie luat în considerare faptul că există multe variabile care pot necesita o ajustare a acestor valori:

volumul de reacție;
poziția tubului în interiorul ciclotermului;
lungimea și cantitatea de ADN șablon;
conținute în perechi GC (perechile GC sunt mai stabile deoarece formează trei legături de hidrogen între ele, astfel încât este nevoie de mai multă energie pentru a le sparge; pentru fiecare procent din GC temperatura de denaturare trebuie să crească cu 0,4 ° C);
soluția de reacție și puterea sa ionică (temperatura de denaturare, de fapt, trebuie crescută cu 16,6 ° C pentru fiecare creștere de 10 ori a concentrației cationilor monovalenți).

Trebuie avut în vedere faptul că creșterile excesive ale temperaturii sau prelungite prea mult pot scădea activitatea ADN polimerazei care la 95 ° C are un timp de înjumătățire de 40 de minute. Pentru a evita probleme similare, este posibil să se recurgă la agenți (cum ar fi formamida ) care destabilizează punțile de hidrogen, astfel încât temperatura de denaturare să poată fi scăzută.
În faza de recoacere , în care primerii apar secvențelor complementare ale țintei, temperatura care trebuie utilizată și durata acesteia trebuie alese având în vedere două aspecte opuse. O temperatură mai ridicată, de fapt, mărește specificitatea reacției, dar poate compromite eficiența acesteia, deoarece favorizează separarea primerilor de țintă (valoarea temperaturii la care există o tranziție de 50% între starea dublă și singură helix se numește temperatura de topire sau de topire ). Dacă temperatura este redusă, condițiile devin mai puțin stricte, dar se favorizează formarea hibrizilor și, prin urmare, a celor amplificate, nespecifice.
Un ghid util în evaluarea temperaturii de recoacere care trebuie adoptată poate fi compoziția perechii GC. Dacă acestea sunt puține, atunci temperatura poate fi mai mică de 55 ° C, altfel trebuie să fie mai mare. O formulă empirică pentru stabilirea temperaturii de topire a unui oligonucleotid ( primer ) poate fi următoarea:

$Tm=2(A+T)+4(G+C)$ ${\ displaystyle Tm = 2 (A + T) +4 (G + C)}$ $Tm = 2 (A + T) +4 (G + C)$
(A, G, C, T reprezintă numărul de adenine, guanine, citozine și, respectiv, timine)

Temperatura de recoacere este stabilită în general prin scăderea a 5 din temperatura de topire calculată conform formulei anterioare. Temperatura de recoacere astfel obținută poate fi un bun punct de plecare pentru primele încercări de instalare a PCR și ulterior poate fi variată, în testele ulterioare, pentru a încerca să îmbunătățească randamentul sau să minimizeze prezența oricăror produse nespecifice.
În faza de extensie, temperatura care trebuie adoptată este cea care corespunde activității enzimatice maxime (de exemplu, se utilizează o temperatură de 70-72 ° C cu polimeraza Taq). Perioada de timp în care se utilizează această temperatură variază în funcție de lungimea fragmentului de amplificat (polimeraza sintetizează 600-1000 baze pe minut), pentru polimeraza Taq un minut este suficient pentru fragmente de 2 Kb. În general, ultima ciclul reacției de amplificare durează mai mult pentru a obține produse cât mai complete posibil. Acest pas este extrem de important în situațiile în care produsele de reacție trebuie să aibă capete bine definite, pentru a le putea folosi, de exemplu, în secvențierea sau clonarea.

Contaminări

Paradoxal, cea mai mare problemă cu PCR derivă din sensibilitatea și eficiența sa ridicate. De fapt, reacția este foarte sensibilă la prezența materialului genetic contaminant care poate fi găsit în diferite locuri: instrumentație, operator, mediu extern. Una dintre sursele majore de contaminare constă în deschiderea unor tuburi care conțin material amplificat (contaminare datorată transportului ) care, după deschiderea containerului, poate fi dispersat în aer sub formă de aerosoli care ar putea contamina PCR-urile ulterioare.
Dacă luăm în considerare, de fapt, că într-un PCR efectuat într-un volum de 100 µl pot fi găsite până la 10 ¹² molecule de ADN, aceasta înseamnă că în 10 ⁻⁷ μl de soluție există 10 ³ catene de ADN, care pot constituie o sursă periculoasă de contaminanți.
Problema contaminării este cu atât mai mare cu cât sensibilitatea PCR este ridicată. O PCR mai puțin sensibilă va fi evident mai puțin predispusă la contaminare, dar va necesita o prezență mai mare a țintei sale pentru a o putea amplifica.
Un alt aspect care trebuie luat în considerare este prezența unui material contaminant de origine ecologică sau celulară. Dorind, de exemplu, să amplifice materialul genomic uman, va exista posibilitatea ca același operator să fie o sursă de contaminare (de exemplu datorită pierderii fragmentelor de piele peeling sau eliberării de picături de salivă). Atunci când aveți de-a face cu microorganisme, poate exista posibilitatea ca acestea să crească în apropierea locurilor în care este pregătită PCR. Este posibilă și contaminarea încrucișată din materialul utilizat ca un control pozitiv care ar putea fi depus în eprubete.
În cele din urmă, există o altă posibilitate de contaminare care poate apărea în timpul procedurilor de detectare a produsului PCR (de exemplu pe gel de agaroză pentru ciclul electroforetic ). În acest caz, este posibil ca materialul dintr-o probă să poată fi adăugat în cantități mici la altul cu posibilitatea unui rezultat fals.
Confruntat cu o problemă atât de importantă ca cea a contaminării (gândiți-vă mai ales la domeniul diagnosticului) este adecvat să se ia măsuri adecvate pentru a minimiza acest risc.
Este absolut esențial ca zona de preparare a amestecului de reacție să fie distinctă de cea în care probele sunt inoculate și de cea în care sunt analizate. Acest lucru se aplică și tuturor instrumentelor care trebuie utilizate. Scopul acestui lucru este de a preveni orice material genomic să contamineze soluția în timp ce este pregătită.
Toți reactivii PCR trebuie împărțiți în alicote destul de mici pentru a preveni deschiderea și închiderea unui tub de prea multe ori. În cazul prezenței unui material contaminant, atunci nu va fi necesar să aruncați tot reactivul considerat poluat, ci doar porțiunea din acesta care a fost utilizată.
Mai mult, reactivii trebuie depozitați în zone în care nu există alte produse PCR sau ADN extras.
Pipetele utilizate în laboratoare sunt una dintre sursele majore de contaminare, deoarece, în faza de aspirație a unei soluții care conține ADN, pot crea aerosoli care sunt depuși pe vârf și care pot polua ulterior alte probe (în special controale negative). Pentru a depăși această problemă, este recomandabil să folosiți sfaturi echipate cu un filtru sau pipete cu expulzare pozitivă. Un alt truc util de utilizat este acela de a utiliza diferite pipete pentru prepararea amestecului de reacție și pentru inocularea ADN-ului.
Toate aceste măsuri trebuie în mod evident inserate într-un context general de bune practici de laborator care ar trebui să includă, printre altele: schimbarea frecventă a mănușilor, curățarea temeinică a tuturor suprafețelor și instrumentelor și închiderea tuturor tuburilor imediat după utilizarea acestora.

Aplicații

PCR este utilizat în toate acele situații în care este necesar să se amplifice o cantitate de ADN până la niveluri utile pentru analizele ulterioare. Domeniile de aplicare sunt enorme. Tehnica este utilizată, de exemplu, în medicină pentru diagnosticarea microbiologică sau pentru detectarea celulelor tumorale, în tumorile lichide, atunci când acestea sunt prea puține pentru a fi detectate prin alte metode ( boală reziduală minimă ). Extrem de utilă este utilizarea PCR în medicina criminalistică . În biologie , PCR este utilizat pentru paleontologie și analize de antropologie moleculară și în numeroase domenii ale ingineriei genetice . Utilizarea sa este, de asemenea, fundamentală pentru studiul genomului organismelor necultivabile, cum ar fi numeroase bacterii și protiști, și pentru studiul populațiilor în ecologie. Utilizarea acestuia permite, de asemenea, detectarea contaminării cu OMG-uri și a oricăror boli genetice. Diferitele grade de specificitate ale grundurilor integrate cu eficiența diferită cu care se leagă de amplificate în funcție de temperatură garantează acestei tehnici o flexibilitate extraordinară pentru studii la toate nivelurile taxonomice diferite.

Variante

În prezent există variante ale PCR clasic, inclusiv:

Notă

^ (RO) Kary B. Mullis, Reacția în lanț a polimerazelor - Facerea ADN-ului accesibil pe www.karymullis.com - site-ul personal. Adus la 15 mai 2013 .
^ Premiul Nobel pentru chimie, 1993
^ Ramakers, C., Ruijter, J., Deprez, R. și Moorman, A. (2003). Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data . Neuroscience Letters, 339(1), 62–66.