Fragment de Okazaki
Un fragment Okazaki este un fragment scurt de ADN sintetizat prin catalizarea ADN polimerazei ( ADN polimeraza III ) în timpul replicării ADN de către catena lentă și a unui primer ARN . Acest fragment este compus din aproximativ 1000 ÷ 2000 nucleotide în celulele eucariote și 100 ÷ 200 nucleotide în celulele procariote .
Formarea fragmentelor Okazaki
Deoarece sinteza ADN-ului poate avea loc doar în direcția 5 '→ 3' și că originea replicării (reprezentată de o secvență specifică de nucleotide) nu se găsește niciodată la capătul 5 'sau 3' (motiv pentru care formează așa-numita bula replicativă ), doar unul dintre cele două filamente aparținând aceleiași benzi , denumit filament de ghidare (sau filament de conducere , filament rapid sau, în engleză, șuviță de conducere ), poate fi sintetizat continuu, utilizând un singur declanșator.
Celălalt filament, pe de altă parte, numită filament întârziată ( de asemenea , numit filament lent sau rămase în toron în limba engleză), trebuie să fie sintetizate în direcția opusă de conducere (în „→ 5 direcția 3“), sub formă de mici fragmente discontinue, fragmente definite cu precizie de Okazaki. Din acest motiv, în realitate, filamentul târziu este deci compus din diferite filamente, a căror sinteză începe în apropierea furcii replicative pornind de la un primer (în engleză primer ) de către un Primasi . Grundul va fi apoi îndepărtat de enzima RNază H și înlocuit cu ADN cu ADN polimerază I. Fragmentul este apoi legat de următorul fragment de ADN ligază printr-o legătură fosfodiesterică pentru a crea un lanț ADN continuu.
Acest model de replicare discontinuă a fost postulat de Reiji Okazaki , care a dovedit existența fragmentelor de ADN, pe care ulterior i-a luat numele.
Rețineți că replicarea ADN este bidirecțională, prin furci de replicare care funcționează în ambele direcții de-a lungul firului dublu al ADN-ului; prin urmare, o singură catenă de ADN conduce simultan pentru duplicare într-o direcție și rămâne în direcția opusă; fragmentele Okazaki se formează pe „jumătățile” parcurse de furcile de replicare în direcția 3 '→ 5', deci pe ambele fire ale dublei spirale ADN.
Experimente Okazaki
În 1967, Reiji Okazaki, Kiwako Sakabe, Nakamoto Yuta și Osaki Shotaro, împreună cu alți colegi, au efectuat câteva experimente care au demonstrat existența acestor fire scurte de ADN: [1]
- au fost înființate culturi ale bacteriei Escherichia coli , care se aflau într-o fază de sinteză activă a ADN-ului;
- aceste culturi au fost supuse unor expuneri scurte (5 secunde) de timidină tritiată , 3 H-timidină, care a fost încorporată în ADN-ul nașterii ( puls );
- s-a adăugat apoi timidină neradioactivă ( urmărire rece );
- imediat după aceea ADN-ul a fost izolat și denaturat într- o soluție alcalină ;
- soluția a fost centrifugată într-un gradient de zaharoză , care a separat firele de ADN pe baza greutății moleculare ;
- diferitele benzi au fost apoi analizate pentru prezența radioactivității.
Experimentul a fost repetat de mai multe ori, prelungind perioadele fazelor pulsului și / sau ale urmăririi .
S-a observat că, atunci când expunerea la nucleotida marcată a fost foarte scurtă (5-10 secunde), cea mai mare parte a radioactivității a fost localizată în fragmente de ADN scurte, cu o lungime de 1000-2000 nucleotide. Extinderea timpului de expunere ( impuls ), pe de altă parte, a crescut fracția de ADN marcat cu cea mai mare greutate moleculară. Același rezultat a fost obținut atunci când perioada de urmărire rece a fost prelungită, înainte de izolarea ADN-ului.
Din aceste observații s-a dedus că ADN-ul a fost sintetizat sub formă de fragmente mici în prima etapă, care au fost apoi unite împreună pentru a forma fire mai lungi. S-a dovedit că enzima ligază a legat fragmentele Okazaki, de fapt, același experiment efectuat cu mutanți cu ligază negativă (bacterii care nu posedau o formă funcțională a enzimei) nu a produs filamente radioactive cu greutate moleculară mare.
Mai târziu, sinteza fragmentelor Okazaki a fost evidențiată și în eucariote .
Telomeri
Deoarece ADN-polimerazele „catenă lentă” nu reușesc să finalizeze sinteza ultimului fragment Okazaki, fiecare cromozom ar trebui să piardă un fragment din sine. Acest lucru ar provoca daune grave funcționalității cromozomului, astfel încât la capetele 3 'și 5' sunt plasate secvențe de nucleotide (TTAGGG pentru majoritatea ființelor vii) repetate de mai multe ori (2500 în cromozomii umani). Aceste secvențe, inutile pentru structura ADN , sunt numite „telomeri” și, cu fiecare duplicare, se pierd din ele 50 până la 200 de nucleotide , astfel încât cromozomul să nu fie modificat. Prin pierderea acelei cantități de nucleotide, cromozomul se poate duplica pentru 20/30, de până la 50 de ori înainte de a ajunge la ADN, ca să spunem așa, limita Hayflick în sine. Cu toate acestea, unele celule sunt capabile să resintezeze telomerii, fiind astfel capabili să le dubleze de un număr infinit de ori, prin utilizarea enzimei specifice pentru această funcție, numită telomerază .
Notă
- ^(EN) Sakabe K, Okazaki R, O proprietate unică a regiunii de reproducere a ADN-ului cromozomial, în Biochimica et Biophysica Acta, vol. 129, nr. 3, decembrie 1966, pp. 651–54, Entrez PubMed 5337977 .
Elemente conexe
linkuri externe
Articolul McGraw Hill Higher Education care discută sinteza ADN-ului
