Procesul Cohn
Procesul Cohn sau fracționarea la rece cu etanol , dezvoltat de Edwin J. Cohn, este o procedură de fracționare a plasmei în scopul extragerii albuminei din plasma sanguină . Metoda Cohn este atât de funcțională încât proteina albumină izolată își păstrează activitatea biologică . [1]
Procesul se bazează pe diferența de solubilitate a albuminei și a altor proteine plasmatice bazate pe pH , concentrația etanolului , temperatura, puterea ionică și concentrația proteinelor. [2] [3] Albumina are cea mai mare solubilitate și cel mai scăzut punct izoelectric dintre toate proteinele plasmatice majore; acest lucru permite produsului final să se separe de soluția sa sub formă solidă.
Albumina a fost un substitut excelent pentru plasma umană în cel de-al doilea război mondial. Când a fost administrat soldaților răniți sau altor pacienți cu pierderi de sânge, a contribuit la extinderea volumului de sânge și a dus la o recuperare mai rapidă.
Istorie și caracteristici
Procesul Cohn a fost o dezvoltare importantă în domeniul fracționării sângelui. Are mai multe utilizări practice în tratarea bolilor precum hepatita și poliomielita. A fost foarte util în timpul celui de-al doilea război mondial, unde soldații s-au recuperat mai repede după transfuziile de albumină. Procesul Cohn a fost modificat de-a lungul anilor, după cum se vede mai sus. În plus, a influențat alte procese cu industria fracționării sângelui. Acest lucru a condus la noi forme de fracționare, cum ar fi fracționarea plasmatică cromatografică în schimbul de ioni și procesele de finisare a albuminei. În general, procesul Cohn și variațiile sale au dat un impuls uriaș și servesc drept bază pentru industria fracționării. [4]
Deși este utilizat pe scară largă, procesul nu a fost încă bine cercetat, deoarece este destul de vechi. Mai important, nu a fost niciodată modernizat de companiile care îl utilizează. Mai mult, procesul convențional poate fi dăunător mediului, deoarece etanolul este o substanță foarte inflamabilă . Formatul de etanol rece poate fi ineficient în eliminarea unor viruși care necesită inactivare termică. Deoarece acest proces rămâne neschimbat atât de mult timp, mai multe ineficiențe și inconsecvențe încorporate afectează economia procesului pentru companiile farmaceutice și producătoare. [4] O excepție de la aceasta a fost aplicarea în Scoția a procesării prin flux mai degrabă decât a procesării în serie. Acest proces a fost conceput la Centrul de Fracționare a Proteinelor (PFC), instalația de fracționare a plasmei a Serviciului Național Scoțian de Transfuzie a Sângelui (SNBTS). Acest proces a implicat monitorizarea și controlul în linie al pH-ului și temperaturii, cu controlul debitului fluxurilor de plasmă și etanol de către pompe de transmisie de precizie, toate sub control computerizat de feedback. Ca rezultat, fracțiile Cohn I + II + III, IV și V au fost produse în câteva ore, mai degrabă decât în multe zile. Pregătirea fluxului prin crioprecipitat a fost ulterior integrată în procesul din amonte de fracționarea Cohn. [5]
Acest proces formează încă o bază majoră pentru industria sângelui în general și a avut o influență uriașă în dezvoltarea celor mai noi metode. Deși are dezavantajele sale în funcție de variație, principalul avantaj al procesului Cohn îl reprezintă utilizările sale practice și utilitatea sa în industriile medicamentoase și medicale.
Detalii despre proces
În timpul operațiilor, concentrația de etanol merge de la 8% până la 40%. PH-ul scade de la neutru (7,2) la 4,8 în timpul fracționării. Temperatura scade de la -3 la -5 grade Celsius.
Inițial, sângele este înghețat. Există cinci cătune principale; fiecare fracție se termină cu un precipitat specific. Aceste precipitate sunt fracțiile separate. [6]
Fracțiile I, II și III sunt precipitate în fazele inițiale. Condițiile etapelor inițiale sunt 8% etanol, pH 7,2, -3 ° C și 5,1% proteină pentru fracțiunea I. Albumina rămâne ca un supernatant în timpul extracției în aceste condiții. Fracțiunea IV are mai multe proteine nedorite care trebuie eliminate. Pentru a precipita aceste proteine, concentrația de etanol merge de la 18 la 40% și crește pH-ul de la 5,2 la 5,8. În cele din urmă, albumina se găsește în fracția V. Precipitarea albuminei se realizează prin reducerea pH-ului la 4,8, care este aproape de punctul izoelectric al proteinei și menținerea concentrației de etanol la 40%, cu o concentrație de proteină de 1% . Prin urmare, doar 1% din plasma originală rămâne în a cincea fracție. [6]
Cu toate acestea, albumina se pierde în fiecare etapă a procesului, cu aproximativ 20% din albumina pierdută în timpul etapelor de precipitare înainte de fracțiunea V. Pentru purificarea albuminei, are loc o extracție cu apă și o ajustare la 10.% etanol, pH 4,5 la - 3 ° C. Orice precipitat format aici este filtrat și este o impuritate. Precipitarea, sau repetarea etapei de precipitare pentru a îmbunătăți puritatea, se face prin aducerea concentrației de etanol înapoi la 40% din etapa de extracție. Au fost create mai multe variante ale fracției Cohn pentru a reduce costurile și a avea un randament mai mare. În general, dacă randamentul este mare, puritatea este redusă la aproximativ 85-90%. [6]
| Fracțiunea I | Fracțiunea II | Fracțiunea III | Fracțiunea IV | Fracțiunea V | |
|---|---|---|---|---|---|
| % Etanol | 8 | 25 | 18 | 40 | 40 |
| pH | 7.2 | 6.9 | 5.2 | 5.8 | 4.8 |
| Temperatura (° C) | - 3 | - 5 | - 5 | - 5 | - 5 |
| Fracțiune proteică (%) | 5.1 | 3 | 3 | 3 | 1 |
Alte produse decât albumina
Cohn a reușit să înceapă Laboratorul de fracționare cu plasmă după ce a primit fonduri substanțiale de la agenții guvernamentale și companii farmaceutice private. Acest lucru a dus la fracționarea plasmei umane.
Fracționarea plasmei sanguine umane a produs albumina serică umană, gamma globulina serică, fibrinogenul , trombina și globulina grupelor sanguine. [7]
Fracțiile de fibrinogen și trombină sunt combinate în continuare în timpul războiului în produse suplimentare, inclusiv fibrină lichidă, [8] fibrină din spumă solidă și fibrină film. [9]
Gammaglobulinele se găsesc în fracțiunile II și III și s-au dovedit esențiale în tratamentul rujeolei pentru soldați, în tratamentul poliomielitei , pentru a modifica și preveni hepatita infecțioasă în timpul celui de-al doilea război mondial.
Adezivul pe bază de fibrină lichidă a fost utilizat în tratamentul victimelor arsurilor, inclusiv unele din atacul de la Pearl Harbor , pentru a atașa grefe de piele cu o rată de succes crescută. [8] S-a găsit, de asemenea, util pentru reconectarea sau anastomozarea nervilor tăiați.
Spuma de fibrină și trombina au fost utilizate pentru a controla transudațiile în leziunile hepatice și în apropierea tumorilor. De asemenea, a minimizat sângerarea venelor mari din creier. Filmul de fibrină a fost utilizat pentru a opri sângerarea în diferite aplicații chirurgicale, inclusiv în neurochirurgie. Cu toate acestea, nu a fost util în controlul sângerărilor arteriale. [7]
Primul produs fibrinogen / fibrină capabil să oprească sângerările arteriale a fost „lipiciul fibrinei” sau „pansamentul hemostatic (HD)” inventat de Martin MacPhee în Crucea Roșie americană la începutul anilor 1990 și testat în colaborare cu armata Statelor Unite . [10] [11]
Variante ale procesului
Metoda Gerlough
Metoda Gerlough, dezvoltată în 1955, a îmbunătățit impactul economic al procesului prin reducerea consumului de etanol. În loc de 40% în anumite etape, Gerlough a folosit 20% etanol pentru precipitații. Acesta din urmă este utilizat în special pentru fracțiile II și III. În plus, Gerlough a combinat cele două fracții cu IV într-un singur pas pentru a reduce numărul de fracții necesare. Deși această metodă s-a dovedit a fi mai puțin costisitoare, nu a fost adoptată de industrie datorită combinației fracțiilor II, III și IV care poate crește numărul de impurități. [12]
Metoda Hink
Metoda Hink s-a dezvoltat în 1957. Această metodă a dat randamente mai mari prin recuperarea unora dintre proteinele plasmatice aruncate în fracțiunile IV. Randamentele îmbunătățite, cu toate acestea, au fost compensate de puritățile mai mici realizate, în intervalul de 85%. [12]
Metoda Mulford
Metoda Mulford, similară cu Hink, a folosit supernatantul fracțiilor II și III ca ultim pas înainte de terminare și tratament termic. Metoda a combinat fracțiile IV și V, dar în acest caz albumina nu ar fi la fel de pură, deși randamentele pot fi mai mari. [12]
Metoda Kistler-Nitschmann
O altă variantă a fost dezvoltată de Kistler și Nitschmann, pentru a oferi o formă mai pură de albumină, deși compensată cu randamente mai mici. Similar cu Gerlough, Precipitatul A, care este echivalent cu fracția Cohn II și III, a fost realizat cu o concentrație de etanol mai mică cu 19%, dar pH-ul, în acest caz, a fost, de asemenea, sub 5,85. În mod similar cu metoda Gerlough și Mulford, fracția IV este combinată și precipitată în condiții de etanol 40%, pH de 5,85 și temperatură de -8 ° C. Albumina, care este recuperată în fracțiunea V, este recuperată în precipitatul C, aducând pH-ul la 4,8. Ca și în procesul Cohn, albumina este purificată prin extracție din apă urmată de precipitarea impurităților în condiții de etanol 10%, pH 4,6 și -3 grade ° C. Similar procesului Cohn, precipitatul format aici este filtrat și aruncat. Apoi precipitatul C (fracțiunea V) este precipitat din nou la pH 5,2 și depozitat sub formă de pastă la -40 ° C. Acest proces a fost acceptat cu mai multă bunăvoință de comunitatea științifică, deoarece separă fracțiile și face ca fiecare etapă să fie independentă una de cealaltă.
| Precipitat: | A | B. | C. |
|---|---|---|---|
| % Etanol: | 19 | 40 | 40 |
| pH: | 5,85 | 5,85 | 4.8 |
| Temperatura (grade C) | - 3 | - 8 | - 8 |
Fracționarea prin căldură cu etanol
O altă variantă include fracționarea căldurii cu etanol. A fost inițial dezvoltat pentru a dezactiva virusul hepatitei. În acest proces, cel mai important obiectiv este recuperarea albuminei de înaltă puritate, de înaltă puritate, în timp ce alte proteine plasmatice sunt neglijate. Pentru a ne asigura că albumina nu este denaturată de căldură, există stabilizatori precum octanoatul de sodiu, care permit albuminei să tolereze temperaturi mai ridicate pentru perioade mai lungi. Plasma este tratată termic la 68 ° C cu octanoat de sodiu cu etanol fierbinte de 9% la pH 6,5. Acest lucru are ca rezultat o recuperare mai bună a albuminei cu randamente de 90% și puritate de 100%. Nu este la fel de costisitoare ca procedurile de fracționare la etanol rece (Procesul Cohn). Un dezavantaj este prezența de noi antigeni datorită unei eventuale denaturări la cald a albuminei. De asemenea, celelalte proteine plasmatice au utilizări practice și pierderea lor în acest proces nu ar merita. În cele din urmă, vasele costisitoare de tratament termic compensează costurile mai mici comparativ cu procesul de etanol rece, care nu are nevoie de el. Din aceste motive, mai multe companii nu au adoptat această metodă chiar dacă rezultatele sunt mai mult decât remarcabile. Cu toate acestea, o organizație proeminentă care folosește fracționarea căldurii cu etanol este Crucea Roșie germană . [12]
Metoda Hao
Cea mai recentă variantă a fost dezvoltată de Hao în 1979. Această metodă este mult simplificată în comparație cu procesul Cohn. Scopul său este de a crea randamente ridicate de albumină, atâta timp cât albumina este singurul produs. Printr-un proces în două etape, impuritățile sunt precipitate direct din supernatantul fracțiilor II și III în condiții de 42% etanol, pH 5,8, temperatură -5 ° C, proteină 1,2% și rezistență ionică 0, 09. Fracția V este precipitată la pH 4,8. Fracțiile I, II, III și IV sunt în etanol 40%, cu un pH de 5,4 până la 7,0 și o temperatură de -3 până la -7 grade C. Fracția V este apoi precipitată la pH 4,8 și - 10 grade C. randamentele se datorează unei combinații a unui proces simplificat, cu pierderi mai mici datorate co-precipitării și utilizării filtrării . 98% puritate este atinsă datorită nivelurilor mai mari de etanol, dar randamentele scad pe măsură ce puritatea crește.
Metode mai recente implică utilizarea cromatografiei . [13]
Notă
- ^ Surgenor, Douglas. Edwin J. Cohn și dezvoltarea chimiei proteinelor. Centrul de cercetare a sângelui.
- ^ Peter Foster, The Kirk -Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, ediția a IV-a, vol. 11, 990-1021 , 1994, pp. 990-1021.
- ^ EJ Cohn, LE Strong și WL Hughes, Prepararea și proprietățile proteinelor serice și plasmatice. IV. A System for the Separation in Fractions of the Protein and Lipoprotein Components of Biological Tissues and Fluids1a, b, c, d , în Journal of the American Chemical Society , vol. 68, nr. 3, 1946, pp. 459–475, DOI : 10.1021 / ja01207a034 .
- ^ a b Petz, LD, Swisher S. Practica clinică a medicinei transfuzionale. Churchill-Livingstone. 1989.
- ^ Fabricarea produselor plasmatice din sânge în Scoția: o scurtă istorie , în Scott Med J , vol. 61, nr. 1, februarie 2016, pp. 34–41, DOI : 10.1177 / 0036933015619311 , PMID 26610795 .
- ^ a b c Harris, James R. Separarea sângelui și fracționarea în plasmă. Wiley-Liss. 1991
- ^ a b Birnie, GD Componente subcelulare: Pregătire și fracționare. Butterworth. 1972.
- ^ a b Cohn, EJ Istoria fracționării plasmei. În Advances in Military Medicine, Andrus și colab. Eds. Little, Brown & Co, 1948.,
- ^ MacPhee, MJ și colab. Etanșanți pentru țesuturi disponibili astăzi. În Tissue Glues in Cosmetic Surgery, Saltz & Toriumi Eds., Quality Medical Publishing, 2004.
- ^ Implicații ale noii tehnologii de etanșare a fibrinei uscate pentru chirurgia traumei , în Surg. Clin. North Am., Voi. 77, nr. 4, august 1997, pp. 943–52, PMID 9291993 .
- ^ Travis, J. Construirea unor bandaje mai bune. Science News Online Vol 155, nr. 25, 19 iunie 1999. Disponibil online la „http://www.sciencenews.org/sn_arc99/6_19_99/bob2.htm
- ^ a b c d Graham, JM, Rickwood, D. Fracționarea subcelulară, o abordare practică. Presa Universitatii Oxford. 1997.
- ^ K. Tanaka, EM Shigueoka și E. Sawatani, Purificarea albuminei umane prin combinarea metodei Cohn cu cromatografia lichidă , în Jurnalul brazilian de cercetări medicale și biologice , vol. 31, n. 11, 1998, pp. 1383–1388, DOI :10.1590 / S0100-879X1998001100003 , PMID 9921272 .
