Bibliotecă
O bibliotecă este o colecție de gene sau fragmente de genă sau genomică , fiecare clonată într-un vector de clonare . Un aspect important al unei biblioteci genetice este reprezentativitatea sa: de fapt se spune că este reprezentativă atunci când conține cel puțin o copie a tuturor secvențelor posibile.
Există două tipuri de biblioteci: biblioteci ADN genomic și complementar (ADNc).
Biblioteca genomică
Când un ADN genomic este extras din celulele unui organism, tăiat cu o enzimă de restricție și populația fragmentelor de ADN obținute este clonată în diverși vectori, se obține o colecție de clone, care conține cel puțin o copie a tuturor secvențelor de ADN prezente în genom. Această colecție se numește bibliotecă sau bibliotecă genomică.
Fragmentarea ADN-ului poate fi realizată prin efectuarea unei digestii cu o endonuclează de restricție și inserarea fragmentelor obținute într-un vector adecvat; posibilele probleme legate de acest mod de acțiune sunt, de exemplu, posibilitatea ca în cadrul aceluiași fragment să existe mai multe situri de restricție de același tip sau posibilitatea ca o genă să fie prea mare pentru a fi conținută într-un fragment care poate fi achiziționat de la un purtător.
Prin urmare, tehnica care prevede utilizarea unui amestec de două enzime de restricție, care sunt lăsate să acționeze doar parțial, este mai avantajoasă, astfel încât să se obțină fragmente lungi cu regiuni suprapuse.
Vectorii utilizați pentru inserarea fragmentelor de ADN genomic pot fi vectori pe baza fagului lambda sau vectori cu capacitate mare, cum ar fi cosmide , cromozomi artificiali bacterieni ( BAC ) și cromozomi artificiali de drojdie ( YAC ).
Biblioteca CDna
Legate de bibliotecile genomice sunt biblioteci ADN complementare (ADNc), numite și „biblioteci de expresie”, colecții de clone care conțin molecule de ADN copiate din ARNm izolate din celule. ADNc este obținut prin reacția de transcripție inversă .
În aceste biblioteci, ADN-ul fără regiunile intronice este apoi clonat și astfel permite analizarea porțiunii de codificare a diferitelor gene analizate, precum și reducerea semnificativă a dimensiunii fragmentelor.
Este adecvat să subliniem că bibliotecile ADNc sunt reprezentative pentru tipul de celule examinate, condițiile lor și expresia genelor lor în curs, spre deosebire de bibliotecile genomice, care sunt egale una cu cealaltă, nu în funcție de parametrii menționați anterior.
Proiectarea unei biblioteci
Screeningul bibliotecilor (genomic sau ADNc) poate avea loc în moduri diferite, dar mai ales prin:
- Hibridizare cu sonde ADN specifice.
- PCR cu primeri specifici.
- Tehnici imunologice
Screening prin hibridizare cu sonde ADN specifice
Screeningul prin hibridizare a sondelor ADN constă în utilizarea secvențelor sintetice de oligonucleotide monocatenare complementare cu întinderea de ADN pe care dorim să o izolăm, pentru a avea o pereche între cele două catene care va fi identificată ulterior datorită diferitelor metode de vizualizare (ex : autoradiografie). Hibridizarea este funcțională, deoarece este ușor de implementat prin:
- variația temperaturii (vezi denaturarea ADN-ului );
- utilizarea alcalinului;
Aceste două proceduri determină divizarea legăturilor de hidrogen care se unesc la bazele ADN, dar nu intervin la nivelul legăturii fosfodiesterice a scheletului .
În general, pentru screening-ul prin hibridizare cu sonde ADN procedăm:
- Prin denaturarea ADN-ului cu catenă dublă și atașarea catenelor divizate la o matrice de nitroceluloză sau nailon.
- Sonde oligonucleotidice sintetice monocatenare marcate cu un cromofor sau radioizotop sunt adăugate la proba fixă de ADN.
- Secvențele complementare, dacă sunt prezente, se împerechează.
- Hibridizarea este verificată prin autoradiografie sau alte metode de vizualizare în funcție de tipul de sondă utilizat.
Dacă sonda nu se dovedește a fi complementară oricărei secvențe de ADN din probă, testul de hibridizare este considerat negativ.
Sondele au de obicei dimensiuni care pot fi între 100 și 1000 pb, deși pot fi utilizate sonde de alte dimensiuni.
Screening prin tehnici imunologice
Dacă nu aveți o sondă specifică pentru ca gena să fie izolată, poate fi utilizată o metodă bazată pe anticorpi . Cu toate acestea, fie un anticorp specific pentru proteina de interes trebuie să fie disponibil, fie obținut cu tehnica de imunizare. Odată ce anticorpul a fost obținut, se efectuează următoarea procedură:
- Clonele sunt preluate din bibliotecă și prin tehnica de replicare-placare (a se vedea Plasarea replicilor ) o probă din fiecare clonă este transferată pe o membrană de nylon sau nitroceluloză.
- Celulele sunt lizate pe membrană și proteinele lizat sunt fixe (proteinele fixe constituie proteomul clonelor incluzând orice proteină corespunzătoare ADN-ului exogen care a fost inserat acolo).
- Anticorpul specific este apoi utilizat și lăsat să acționeze timp necesar pentru stabilirea legăturii antigen-anticorp.
- Excesul de anticorp care nu s-a legat este spălat.
- Se adaugă un anticorp secundar care este un anticorp. Această moleculă are sarcina de a recunoaște anticorpul specific care a fost utilizat anterior și este de obicei conjugat cu o enzimă (de exemplu fosfatază alcalină) sau cu o substanță cromogenă.
- Excesul de anticorp secundar este spălat.
- Procedăm cu identificarea coloniei de interes fie prin adăugarea substratului enzimei conjugate, fie prin realizarea reacției cromogene.
În acest moment este posibil să urmăriți colonia sau coloniile care conțin inserția de interesul meu (pata strălucitoare sau colorată corespunzătoare unei colonii specifice). Acum, cu toate acestea, este necesar să se analizeze inserția de ADN exogenă a coloniei prin secvențierea sau alte tehnici pentru a verifica dacă conține toată gena sau doar o parte a acesteia.
Depistarea prin activitate proteică
Există multe variații ale acestor tehnici, dar procedura de bază se bazează pe crearea unui test de placă pentru identificarea membrilor bibliotecii care poartă o genă funcțională pentru enzimă exprimată de o genă țintă care nu este produsă în mod normal în celulă . Protocoalele diferă în funcție de tipul de genă țintă utilizată.
- În cazul unei gene esențiale, o linie celulară este eliminată pentru gena de interes și după transformarea celulelor cu vectorul care poartă gena țintă, sunt selectate celulele care supraviețuiesc în mediul de cultură.
- Pe de altă parte, în cazul unei gene care nu este exprimată în mod normal în celula gazdă, se fac teste specifice pentru activitatea enzimatică de interes și sunt asociate pentru a obține o reacție cromogenică sau luminoasă pentru a avea o selecție a clonei.
Bibliografie
- Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, Biotehnologie moleculară. Principii și aplicații ale ADN-ului recombinant , Zanichelli, 1999, ISBN 88-08-14696-0 .
- Sandy Primrose, Richard Twyman, Bob Old, Inginerie genetică. Principii și tehnici , Zanichelli, 2004, ISBN 88-08-07581-8 .
Alte proiecte
-
Wikimedia Commons conține imagini sau alte fișiere pe Genoteca
linkuri externe
- ( EN ) Genoteca , în Encyclopedia Britannica , Encyclopædia Britannica, Inc.
