Imunoprecipitarea cromatinei
Imunoprecipitarea cromatinei (ChIP) este o tehnică experimentală utilizată în analiza interacțiunilor dintre ADN și proteine și pentru studiul alterărilor epigenetice ale histonelor , proteine de bază care alcătuiesc componenta structurală a cromatinei . Această metodă își propune să studieze asocierea proteinelor reglatoare care se leagă de regiuni genomice specifice, cum ar fi: factorii de transcripție pe promotori , pentru a evidenția unitățile de codificare.
ChIP este o tehnică utilizată pe scară largă, iar analiza se efectuează in vivo . Celulele sunt tratate cu un agent care determină formarea de legături încrucișate covalente între ADN și orice proteine legate de acesta. Ulterior, cromatina extrasă din celule este fragmentată, produsul astfel obținut este expus la anticorpul îndreptat împotriva proteinei și dacă acesta este prezent, complexul va fi imunoprecipitat.
Fragmentele de ADN recuperabile din imunoprecipitare vor fi purificate și se va determina secvența lor, cu ideea că este legată de proteină . Pe lângă evidențierea locului în care anumite proteine leagă ADN-ul , este posibil să se identifice noi site-uri de legare și, în consecință, noi interacțiuni. Există două tipuri principale de chIP care diferă în prepararea cromatinei inițiale: primul folosește cromatina fragmentată prin sonicare și se numește XchIp , al doilea folosește cromatina fragmentată prin digestie cu nuclează și se numește NchIP . Acestea sunt utilizate în mai multe scopuri: XchIP pentru a mapa site-urile țintă ale factorilor de transcripție, în loc de NchIP pentru a cartela site-urile țintă ale modificatorilor de histone. Această tehnică poate fi utilizată și pentru a determina interacțiunile dintre proteine și ARN , în acest caz se numește RIP. Principiul de bază este același, cu excepția faptului că RT-PCR trebuie utilizat în analiza imunoprecipitatului.
Metodă
Celulele sunt spălate cu un tampon (de obicei PBS) și se adaugă 1% formaldehidă (care favorizează legarea dintre proteină și ADN) și incubate în general 10 - 15 minute (în funcție de tipul de tampon utilizat) la temperatura camerei 0,125 glicină molară este adăugat care are funcția de a opri reacția de reticulare între proteine și ADN. Fixarea poate avea loc și cu tratament cu lumină UV. Celulele sunt spălate cu PBS și ulterior lizate. Al doilea pas este fragmentarea cromatinei prin sonicare, nuclează sau digestie de restricție.
Anticorpul primar este apoi adăugat și incubat la 4 ° C timp de 12 ore, apoi se adaugă proteina A / G imobilizată pe sfere din diverse materiale, care a fost legată anterior de un anticorp secundar care îl recunoaște pe cel primar. Întregul este incubat timp de 2 ore la 4 ° C. Sferele sunt recuperate prin centrifugare, sunt depuse în sediment, spălate cu un tampon și complexele ADN-Proteine sunt eluate din sfere. ADN-ul nelegat va rămâne în supernatant. Este incubat la 66 ° C timp de 6 ore pentru a inversa reticularea, apoi ADN-ul este recuperat (extragându-l prin fenol / cloroform), care va fi apoi analizat prin PCR.
Amplificarea are loc cu primerii specifici pentru secvența de care se crede că este legată proteina de interes. La urmărirea metodei, este recomandabil să se ia în considerare unele precauții fundamentale:
- fragmentele de cromatină trebuie să fie de 0,5 / 1 Kb, pentru a obține o amplificare corectă și pentru a preveni formarea nespecifică în timpul imunoprecipitării.
- anticorpul trebuie să fie foarte specific.
re-ChIP
Tehnica care permite identificarea legăturilor mai multor proteine la o secvență ADN. Principiul rămâne neschimbat, doar că o primă imunoprecipitare este urmată de o a doua în care un anticorp specific este utilizat pentru un factor diferit.
Bibliografie
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=chromatin%20immunoprecipitation
- Biologia moleculară a genei, ediția a VI-a, WATSON JD BAKER TA BELL SP GANN A., Zanichelli
Elemente conexe
Alte proiecte
-
Wikimedia Commons conține imagini sau alte fișiere despre imunoprecipitarea cromatinei
