Experiment Meselson-Stahl
Această intrare sau secțiune despre subiectul biochimiei nu citează sursele necesare sau cei prezenți sunt insuficienți . |
Experimentul lui Matthew Meselson și Franklin Stahl din 1958 a fost fundamental în determinarea mecanismului semiconservator al replicării ADN- ului.
La acea vreme, modelul ADN-ului cu dublă helică propus de James Watson și Francis Crick era deja cunoscut și acceptat. Acest model a prezis că cele două helice ADN s-au împerecheat între ele pentru a forma o dublă helix prin interacțiuni slabe (legături de hidrogen, repulsie electrostatică a grupărilor fosfat, interacțiune hidrofobă a bazelor azotate). De asemenea , se preconizează că cele două helices la nivelul INTERACT al bazelor azotate , în special numai complementare împerecherile Adenin - timină și Citosin - guanina erau posibile .
Watson și Crick au propus (de fapt într-un mod voalat și fără a aduce nicio dovadă) că, din moment ce posibilele împerechere erau exclusiv cele menționate, fiecare dintre cele două helici conținea informațiile necesare pentru a construi helica complementară . Acest lucru a sugerat un sistem simplu și eficient pentru replicarea materialului genetic: la momentul replicării, cele două spirale ar trebui să se separe și fiecare dintre acestea ar fi servit drept șablon pentru helica complementară.
În acest sens, vorbim de replicare semi-conservatoare, deoarece în noile spirale duble unul dintre cele două filamente era prezent în dubla spirală originală, celălalt este sintetizat recent.
La momentul experimentului, suntem pe cale să descriem, pe lângă modelul de replicare semiconservatoare, au fost propuse alte două mecanisme: replicarea conservatoare și replicarea distributivă .
Replicarea conservatoare a avut în vedere că pornind de la o dublă spirală de ADN, după replicare, au fost obținute două: prima conținând atât firele originale, cât și a doua conținând două fire complementare de sinteză nouă.
Replicarea distributivă ar putea fi imaginată ca o încrucișare între replicarea semi-conservatoare și cea conservatoare.
Schema experimentului
Meselson și Stahl au crescut bacteriile Escherichia coli într-un mediu de cultură bogat în izotopul greu 15 N. Aceste microorganisme au metabolizat 15 N care a fost apoi introdus în multe molecule biologice; printre aceste molecule trebuie să ne amintim bazele azotate ale ADN-ului.
În acest fel, ADN-ul prezent în bacterii a fost un „ ADN greu ”, deoarece a încorporat atomi de azot mai grei decât în mod normal.
Cei doi oameni de știință s-au asigurat că păstrează bacteriile în acest mediu de cultură suficient de mult timp pentru a se asigura că tot ADN-ul este de fapt greu .
Unele bacterii au fost apoi colectate, lizate și, cu tehnici de laborator adecvate, ADN-ul lor a fost extras. Acesta din urmă a fost adăugat într-o eprubetă care conține o soluție concentrată de clorură de cesiu ( CsCl 6M). Tubul a fost apoi centrifugat. În aceste condiții se formează un gradient de densitate în eprubetă, deoarece CsCl tinde să se concentreze spre fundul eprubetei.
Odată format gradientul de densitate, ADN-ul (dar în general orice moleculă din eprubetă) migrează pentru a se opri în regiunea soluției care are aceeași densitate ca a sa.
ADN-ul poate fi evidențiat în urma introducerii unor substanțe particulare care se leagă de el și devin vizibile atunci când sunt iluminate de lumina ultravioletă .
Această tehnică specială se numește centrifugare cu gradient de densitate (sau izopicnic) și în acest context, așa cum se va înțelege mai târziu, servește la „ cântărirea ” ADN-ului extras.
Ceea ce a fost văzut experimental a fost o bandă către partea de jos a tubului.
În acest moment, unele bacterii au fost transferate din primul mediu de cultură într-un nou mediu „standard”, în care a fost prezent 14 N în loc de 15 N. Microorganismele au metabolizat azotul prin includerea acestuia în bazele azotate ale nucleotidelor care se vor forma (printre celelalte lucruri) noile helice ADN.
După douăzeci de minute, care este timpul necesar formării unei noi generații de bacterii (adică replicarea ADN-ului), unele bacterii au fost luate din mediul „standard”, lizate și ADN extrase. După o centrifugare cu gradient de densitate, s-a obținut o singură bandă plasată într-o poziție mai înaltă decât cea din cazul precedent: ADN-ul a fost deci mai ușor . Aceste rezultate au exclus imediat posibilitatea unei replicări conservatoare, deoarece, pentru a confirma acest model, în urma experimentului ar fi trebuit să se formeze două lanțuri foarte diferite (care ar fi format două benzi și nu una, așa cum sa întâmplat): una mai jos, deci grea, identică cu cea de pornire și una mai înaltă în eprubetă, ușoară, făcută doar din filamente nou sintetizate. Cu toate acestea, modelul dispersiv nu a putut fi încă exclus, deoarece greutatea intermediară a noului fir poate fi datorată alternanței pe helicile ADN a zonelor cu azot ușor și a zonelor cu azot greu.
După timpul necesar pentru replicarea ulterioară a ADN-ului, procedura de mai sus a fost repetată. În acest caz s-au obținut două benzi: prima într-o poziție net superioară celor obținute în cazurile anterioare, a doua în aceeași poziție ca cea a experimentului anterior. Prin urmare, acest rezultat a exclus modelul dispersiv: formarea a două benzi distincte a arătat că nu a existat o amestecare aleatorie de părți de ADN ușor și părți de ADN greu, de fapt în acest caz s-ar fi format doar o bandă care, din generație în generație generație , s-ar depune din ce în ce mai sus, până la atingerea zonei corespunzătoare densității de 14N (deoarece mediul de cultură a fost întotdeauna 14N, ușor). În schimb, formarea a două benzi clare a arătat că firul greu păstra mereu același (întotdeauna asociat cu un fir ușor), astfel încât molecula ADN cu firul greu a fost întotdeauna depusă în același punct. Din generație în generație, banda de ADN ușoară s-a îngroșat (deoarece bacteriile au continuat să se reproducă în azotul ușor), dar banda intermediară de ADN a fost întotdeauna conservată.
Pe scurt, putem identifica:
- un ADN „ greu ”. În care erau două 15 N filamente.
- un ADN „ mediu ”. În care exista un filament de 15 N și un filament de 14 N.
- un ADN „ ușor ”. În care erau două 14 N filamente.
Bibliografie
- (EN) Meselson, M. și Stahl, FW, Replication of DNA in Escherichia coli , în PNAS, vol. 44, 1958, pp. 671–82, DOI : 10.1073 / pnas.44.7.671 , PMC 528642 , PMID 16590258 .
Alte proiecte
-
Wikimedia Commons conține imagini sau alte fișiere din experimentul Meselson-Stahl
