Genetica inversă
Termenul de genetică inversă se referă la o abordare specială a analizei genetice care, pornind de la genotip, identifică fenotipul. În schimb, genetica clasică duce la determinarea unui anumit genotip pornind de la analiza fenotipului.
Genetica inversă este o metodă de genetică moleculară care este utilizată pentru a ajuta la înțelegerea funcției unei gene prin analiza efectelor fenotipice ale secvențelor specifice de acid nucleic după modificarea genetică. Procesul se desfășoară de obicei în direcția opusă așa-numitelor ecrane genetice avansate ale geneticii clasice. Cu alte cuvinte, în timp ce genetica directă încearcă să găsească baza genetică a unui fenotip sau trăsătură, genetica inversă încearcă să găsească care fenotipuri apar ca urmare a unor secvențe genetice particulare.
Secvențierea automată a ADN generează volume mari de date ale secvenței genomice relativ rapid. Multe secvențe genetice sunt descoperite înainte de alte informații biologice, mai puțin ușor de obținut. Genetica inversă încearcă să lege o anumită secvență genetică cu efecte specifice asupra organismului.
Introducere
Odată cu apariția secvențierii ADN moderne și a tehnologiilor PCR , cercetătorii s-au confruntat cu un număr mare de secvențe genetice a căror funcție era încă necunoscută. Prin urmare, a apărut necesitatea modificării secvenței și, prin urmare, a funcției acestor gene pentru a studia consecințele lor la nivel fenotipic. În acest sens, au fost utilizate diverse tehnici de mutageneză și de reducere a genei.
Tehnici utilizate
Mutageneză directă a sitului
Cunoscând secvența unei gene, este posibil să se efectueze experimente de mutageneză specifică site - ului (sau mutageneză direcționată pe site) pentru a observa orice variații ale fenotipului datorate mutației uneia sau mai multor baze azotate. În special, aceste modificări ale secvenței ADN normale pot fi reflectate într-un produs proteic modificat. De fapt, atunci când această secvență este transcrisă, ARNm corespunzător va fi diferit de tipul sălbatic și, prin urmare, în cazul unei posibile translații la nivel citoplasmatic, se va obține o secvență de aminoacizi diferită în comparație cu secvența normală a proteină codificată de genă.în cauză (conform codului genetic ). „Noua” proteină astfel obținută ar putea, într-un fel, să aibă efecte asupra fenotipului și, prin urmare, prin această strategie este posibil să se înțeleagă funcția genei studiate.
Pe lângă inhibarea producției unei proteine (eliminarea genei) sau crearea produselor proteice modificate, se poate face supraexprimarea unei gene de interes, astfel încât fenotipul rezultat să dezvăluie funcția normală a genei.
Mutațiile genice care pot fi inserate în secvența originală sunt substituții de baze azotate sau inserții sau deleții de nucleotide. De asemenea, este posibil să se genereze mutații cromozomiale .
Mutațiile pot afecta regiunile de codificare ( exoni ) și non-codificatoare ( introni ) ale unei gene, rezultând efecte diferite asupra produsului genetic.
Metodele de mutageneză directă la locul sunt următoarele:
- Mutageneză directă din oligonucleotide : prin utilizarea unei oligonucleotide monocatenare;
- Mutageneza casetei : prin utilizarea unei oligonucleotide dublu catenare.
Ambele generează substituții, inserții și deleții de nucleotide unice (mutații genetice punctuale); cu mutageneza casetei este posibilă și producerea ștergerii mai multor nucleotide (mutație genică extinsă).
Tehnicile directe de mutageneză oligonucleotidică utilizează reacția în lanț a polimerazei (PCR), vectori plasmidici (cu sau fără ajutorul PCR) sau vectori fagemidici (inclusiv fagul M13 ).
Mutageneză aleatorie
Tehnicile de mutageneză directă a sitului necesită nu numai cunoașterea secvenței care trebuie modificată, ci și o anumită cunoaștere a proprietăților proteinei produse de gena examinată. Dacă, pe de altă parte, structura și funcția proteinei nu sunt cunoscute, este posibil să se modifice secvența genei prin mutageneză aleatorie.
Termenul „aleatoriu” înseamnă imposibilitatea de a prezice fenotipul produs de mutație, prin urmare procedăm la inserarea mutațiilor „la întâmplare” în secvență, fără a selecta nucleotide specifice. Pe baza rezultatului fenotipic obținut, mutația care a generat-o va fi apoi identificată.
Mutageneza aleatorie este implementată prin intermediul:
- Grunduri degenerate : produc diverse înlocuiri.
- Analogi ai bazelor azotate : elemente având o structură chimică similară cu bazele purinice și pirimidinice care înlocuiesc, prin urmare, bazele azotate originale. Problema apare atunci când ADN-polimeraza în timpul replicării întâlnește analogi de bază, rezultând nepotriviri. De exemplu, folosind 5-bromouracil (5-BrU) ca analog al timinei (T), nu se împerechează cu adenina (A), ci cu guanina (G), modificând astfel secvența genică.
- Agenți care modifică baza : substanțe chimice (numite și mutageni) care determină modificări ale structurii chimice a bazelor azotate. Astfel de modificări includ: îndepărtarea grupărilor amino din guanină, citozină și adenină (timina nu posedă grupe amino) prin agenți de dezaminare; adăugarea de grupări hidroxil (-OH) de către agenți de hidroxilare; adăugarea de grupări alchil prin agenți de alchilare. Bazele astfel modificate au proprietăți modificate care se reflectă într-o pereche anormală între bazele în sine.
- Agenți intercalatori : se interpun în dubla helică a ADN favorizând inserțiile și delețiile.
- Radiații : Atât radiațiile ultraviolete (UV) , cât și razele X afectează ADN-ul. În special, razele X, care posedă energie ridicată, sunt capabile să inducă ionizarea în celulele afectate, în timp ce razele UV sunt responsabile pentru asocierea neobișnuită și dăunătoare a timinelor cu formarea așa-numiților dimeri timinici.
- Aflatoxina B1 : cancerigen puternic care induce detașarea guaninei, care este înlocuită cu o adenină.
Silențiere genetică de către RNAi
Dacă nu aveți cunoștințe precise asupra secvenței genetice sau dacă nu intenționați să afectați fundalul genetic prin crearea unui organism modificat genetic , este încă posibil să efectuați un studiu funcțional asupra proteinelor. De fapt, eliminarea expresiei genelor poate fi implementată și acționând asupra ARNm și nu numai asupra ADN-ului, asigurându-se că împiedică traducerea mesagerului genei studiate.
Sistemul este cunoscut sub numele de interferență ARN (ARNi), deoarece folosește ARN-uri specifice pentru a „opri” traducerea unui ARNm dat. Mecanismul se bazează pe complementaritatea dintre ARNm în curs de examinare și ARNi, care determină degradarea țintei și, prin urmare, lipsa de sinteză a proteinei. Prin urmare, va fi posibil să se observe efectele fenotipice ale acestui „ knockout (sau knockdown) ” funcțional pur și simplu prin injectarea unui ARN specific care interferează în celule.
Printre principalele molecule implicate în acest mecanism de reducere a zgomotului, se pot menționa siARN și miARN .
Această tehnică are avantaje excelente, dar are și limitări, legate de riscul de a provoca daune grave celulei, de exemplu, ducând la moartea celulară programată .
Datorită dezvoltării secvențierii ADN și a sistemelor de PCR, este acum posibil să se detecteze chiar mutații genetice care nu corespund variațiilor fenotipice evidente.
Tehnicile de mutagenitate permit să studieze atât relațiile dintre structura și funcția unei proteine , cât și expresia genelor și reglarea acesteia. Acestea sunt mijloace puternice de producere a proteinelor cu caracteristici mai bune decât cele găsite în natură. De fapt, pot fi create proteine cu activitate catalitică crescută și, prin urmare, stabilitate și specificitate mai mare pentru substrat, precum și proteine himerice, adică produse prin fuziunea secvențelor de ADN aparținând mai multor gene, chiar provenind de la organisme din diferite specii.
Elemente conexe
linkuri externe
- ( EN ) Reverse Genetics , în Encyclopedia Britannica , Encyclopædia Britannica, Inc.
