Șoricel knockout
Un șoarece knockout este un șoarece modificat genetic în care expresia unei anumite gene este suprimată în scopuri de studiu. Această suprimare se numește knockout genetic (sau knockout genetic ). Primul mouse knockout a fost creat de Mario Capecchi , Martin Evans și Oliver Smithies la sfârșitul anilor 1980 și le-a adus Premiul Nobel pentru medicină pe 8 octombrie 2007 .
Procedura de obținere a șoarecilor knock-out
Faza inițială constă în studiul aprofundat al genei și căutarea exonilor săi critici; de fapt nu este posibilă distrugerea unei gene întregi în eucariote superioare și, prin urmare, este necesar să se acționeze prin ștergerea zonelor critice: este necesar să se cunoască secvența nucleotidică , prezența polimorfismelor ( nucleotidă unică și lungimea fragmentelor de restricție ) și poziția sa specifică în genom . În acest moment sunt alese tipul vectorului de inserție (de obicei în jur de 100-200 bp ) și modul de inactivare. Vectorul este inserat prin transfecție ( electroporare , tun genetic , etc.). Vectorul este astfel inserat în celule pluripotente (celule stem embrionare) colectate anterior și crescute in vitro . În cea mai obișnuită practică se folosesc vectori de înlocuire (vector de înlocuire); de exemplu, conțin gena care urmează să fie studiată, dar într-o formă mutantă inactivă: gena, prin omologia secvenței, odată ce a intrat în nucleu, poate fi substituită cu cea activă originală prin recombinare omoloagă, determinând astfel knock-out-ul genei . Recombinarea omologă în eucariote superioare este totuși un eveniment rar și pentru a crește probabilitatea ca aceasta să apară, vectorul de transfecție trebuie proiectat astfel încât markerul NEO să fie flancat de secvențe omoloage genei care urmează să fie distruse de o lungime considerabilă.
Selectarea celulelor transfectate
O problemă importantă constă în faptul că vectorii sunt capabili să intre în celulă și să se înlocuiască corect foarte rar. Prin urmare, a fost necesar să se introducă tehnici pentru a selecta numai celulele în care transfecția a fost efectuată corect. În trecut, PCR a fost esențială pentru a verifica ce celule au fost efectiv transfectate; astăzi, mai simplu, se folosesc vectori de selecție pozitivi / negativi care utilizează markeri de selecție anumiți. Se utilizează doi markeri: primul este de obicei o genă care conferă rezistență la un antibiotic ; gena este inserată foarte aproape de cea pentru a fi inactivată sau chiar în interiorul ei; în acest fel, adăugarea antibioticului în cultură va supraviețui numai celulelor în care vectorul cu gena (inclusiv cel pentru rezistența la antibiotic) a fost introdus stabil în genom. Cu toate acestea, se poate întâmpla ca vectorul să se insereze prin recombinare neomologă în orice punct al genomului: în acest caz nu avem inactivarea genei dorite, ci inserarea aleatorie în orice alt punct al genomului. Pentru a evita acest lucru, este utilizat un al doilea marker: este de obicei o secvență de codificare pentru timidin kinază ( TK ). Secvența este plasată într-o poziție detașată față de gena de înlocuit; timidin kinaza este o enzimă capabilă să activeze forma toxică a ganciclovirului . În consecință, întrucât secvența pentru TK este greu inserată prin recombinare omologă, prin adăugarea de ganciclovir, vor supraviețui numai celulele transfectate care au suferit recombinare omologă. O PCR de verificare este totuși recomandabilă pentru a evita falsurile pozitive. Dacă se folosește doar PCR pentru control, se va face o primă verificare a celulelor recombinate și o a doua verificare pentru a selecta cele în care recombinarea a fost omologă pe una dintre cele două alele.
Inserarea celulelor transfectate
Aceste celule sunt apoi introduse în blastocistul unei femele de șoarece însărcinate și animalul knock-out este dezvoltat. Culoarea părului este utilizată ca mecanism de control, de exemplu, dacă blastocistul donator generează șoareci negri, vom implanta celule stem de la șoareci albi și reinjectăm totul. Dacă celulele se înrădăcinează, descendenții vor consta din șoareci cu pete albe și negre, altfel vom avea doar șoareci negri. Odată ce lanțul de aprovizionare se naște, himerele masculine alb-negru sunt încrucișate cu femele albe, pentru a avea șoareci albi și șoareci negri, aceștia din urmă vor fi aruncați imediat, albii vor fi în schimb analizați de PCR pentru a putea stabili dacă sunt heterozigoti knock-out . În acest moment , heterozigoții knock-out vor fi încrucișați între ei pentru a obține un lanț de knock-out homozigot de 25% (vezi Mendel ). Dacă mutația este incompatibilă cu viața, adică gena de studiu este indispensabilă și nu apar mecanisme de compensare a genei pe ea, knock-out-ul homozigot va muri în timpul vieții uterine sau în primele zile de viață (de obicei din septicemie ).
Knock-Out-uri condiționate
Astăzi sunt creați șoareci condiționați knock-out , adică knock-out numai în țesuturi specifice. Cu această tehnică, gena este inactivată numai atunci când țesutul a terminat procesul de diferențiere; deci, dacă gena este vitală pentru dezvoltarea embrionară, „oprindu-se” când dezvoltarea este completă, aceasta nu va determina moartea prematură a embrionului de șoarece. De exemplu, un knock-out pentru receptorii nicotinici lipsește sistemul nervos care funcționează autonom și copilul ei nenăscut va muri de diverse infecții, dacă nu în timpul vieții uterine, imediat după naștere. În eliminările condiționate , recombinarea omologă are loc doar într-un țesut dat și, prin urmare, este compatibilă cu viața. Cel mai faimos sistem este așa-numitul sistem Cre / LoxP . Folosește un vector viral, fagul P1, care exprimă recombinaza CRE , care recunoaște o secvență specifică de 34 bp. Receptorii sunt creați cu secvențele de recunoaștere pentru CRE ( receptorii LOX ) și knock-out-ul corespunzător care va avea un exon cu secvența LOX și, în paralel, vom crea și un șoarece transgenic care va exprima CRE numai în țesuturile care au LOX iar la încrucișare, gena va fi tăiată numai în țesutul respectiv, obținându-se astfel un knock-out condițional spațial. Dacă, pe de altă parte, dorim ca eliminarea să aibă loc numai după naștere, vom pune un promotor inductibil, de exemplu prin intermediul tetraciclinei , pe care îl putem activa la momentul potrivit pentru a obține așa - numita lovitură condițională spațiu-timp. -afară . Când CRE găsește secvențe LOX aranjate nu în tandem, ci separate de alte secvențe, inversează secvența intermediară (de exemplu un exon ), astfel încât eliminarea bolnavului să poată fi vindecată prin rotirea exonului.
Bibliografie
- JD Watson Biologie moleculară a genei , Zanichelli, 2005.
- B. Alberts, Biologia moleculară a celulei , Zanichelli.
Elemente conexe
linkuri externe
- ( EN ) Knockout mouse , în Encyclopedia Britannica , Encyclopædia Britannica, Inc.
