Cromatografie lichidă de înaltă performanță
Cromatografia lichidă de înaltă performanță (în limba engleză High Performance Liquid Chromatography, cunoscut anterior ca cromatografia lichidă de înaltă presiune, sau cromatografia lichidă de înaltă presiune), mai simplu cunoscut sub acronimul englezesc HPLC este un tip de cromatografie în fază lichidă , care reprezintă evoluția instrumentală a lichidului Cromatografia pe o clasică coloană .
Este o tehnică cromatografică care permite separarea doi sau mai mulți compuși prezenți într-un solvent, prin exploatarea echilibrului afinității între o „fază staționară“ plasate în interiorul coloanei cromatografice și o „fază mobilă“, care curge prin ea. O substanță mai asemănătoare cu faza staționară decât faza mobilă durează mai mult timp pentru deplasare prin coloană cromatografică (timp de retenție), comparativ cu o substanță cu afinitate scăzută pentru faza staționară și ridicat pentru faza mobilă.
Proba de analizat este injectat la începutul coloanei cromatografice, unde este „împins“ prin faza staționară prin faza mobilă prin aplicarea presiunilor de ordinul a sute de atmosfere. Pentru a obține o eficiență ridicată în separarea este necesar ca dimensiunea particulelor de umplere este foarte mică (de obicei, ele au diametre cuprinse între 3 și 10 pm), pentru acest motiv, este esențial să se aplice o presiune ridicată, dacă doriți să mențină un debit de viteză rezonabilă a eluentului și , prin urmare , un timp de analiză adecvată.
La capătul coloanei se aplică un detector ( IR , UV-VIS, spectrofluorimetric, spectrometru de masă ) și un calculator care să permită o analiză continuă a producției coloanei și , prin urmare , să fie în măsură să cuantifice și / sau pentru a identifica substanțele injectate printr - un specific cromatogramă .
Principalele avantaje ale acestei tehnici sunt: dimensiunea redusă a coloanei care evită problemele de deviații longitudinale (mișcări ale fazei mobile longitudinale) și de căi alternative; Rata de eluție constantă și reglabilă (trecerea fazei mobile prin coloană); viteză redusă de execuție; cantități mici de compus necesar pentru analiză (în ordinea de 5-10 micrograme de probă solubilizate într-un anumit solvent) toate în favoarea mai mare acuratețe și precizie.
Principalul dezavantaj al dispozitivelor HPLC este costul mai ridicat mult în comparație cu cromatografia pe coloană tradițională, chiar dacă nu este posibil să se compare cele două metode, deoarece acestea au diferite domenii de aplicare.
Tipuri de HPLC
Cele mai importante tehnici de cromatografie lichidă sunt:
- cromatografia Distribuție
- Adsorbția cromatografia în coloana cromatografică este acoperit cu un material absorbant.
- Cromatografie ionică (IC) , coloana cromatografică este acoperit cu o rășină schimbătoare de ioni anionic sau cationic, în funcție de faptul dacă schimburi de anioni sau cationi; în plus, rășina poate fi schimbătoare de ioni puternic sau slab. Recent, această primă coloană este asociată cu o a doua coloană numită supresie, pentru a crește rezoluția.
- Excluderea moleculară pentru cromatografie (SEC)
Adesea, procedurile diferite sunt complementare între ele.
Instrumentaţie
Din cauza presiunilor ridicate de operare, instrumente pentru HPLC este de obicei mai complexă decât cea pentru alte tehnici cromatografice. Principalele componente ale echipamentului HPLC sunt:
- Containere pentru faza mobilă
- pompe
- Sisteme de introducere a probelor
- Coloană
- Umplerea coloanei
- Detectoare
Containere pentru faza mobilă
Instrumentele HPLC moderne sunt echipate cu containere diferite pentru solvenții care vor fi utilizați ca fază mobilă. Solvenții trebuie neapărat să fie liber de impurități, inclusiv gaze dizolvate și particule, pentru a nu afecta bunătatea analizei; din acest motiv containerele integrează adesea degassers, fotografii și sisteme de filtrare. In majoritatea cazurilor, solvenții sunt lăsate în recipientele originale, realizate din material inert (sticlă sau oțel inoxidabil).
Separări cu HPLC poate fi realizată cu eluție izocratică, adică folosind un eluent a cărui compoziție nu variază în timpul analizei, sau cu gradient de eluție, în care natura eluentului variază în timpul analizei într - un mod continuu sau în trepte. A doua metodă are efecte similare cu programele de temperatură adoptate în cromatografia de gaze , acesta ajută în multe cazuri , pentru a îmbunătăți rezoluția analizei sau pentru a micșora timpul său. Pentru a opera cu un gradient de eluție este necesar ca instrumentul este echipat cu un amestec de camera în care solvenții luate din containerele sunt amestecate și apoi trimis la coloană.
Pompe
Pompe HPLC trebuie să îndeplinească cerințe foarte stricte, printre care cele mai importante sunt:
- capacitatea de a rezista la presiuni de până la sute de atmosfere
- stabilitatea presiunii generate (importante pentru a nu crea zgomot în cromatograma)
- livra fluxuri de fază mobilă în mod obișnuit domeniul de la 0,1 la 10 ml / min
- asigura reproductibilitatea fluxului relativ mai bun decât 0,5%
- rezistență la coroziune
Principalele tipuri de pompe utilizate în instrumente sunt: pompe cu piston cu piston, pompe seringă și pompe pneumatice.
Pompe cu piston alternativ
Pompe cu piston sunt împărțite în două tipuri: un singur piston și pereche de pistoane (pompe numite cu piston), acestea sunt cele mai comune în instrumente comerciale. Presiunea este transmisă de către piston, acționat de un motor, la o cameră mică în care se face solventul să curgă datorită deschiderii și închiderii a două supape sincronizate cu pulsația pistonului. Cursa de aspirație solvent se efectuează la viteza maximă a motorului este posibil, în timp ce cursa de distribuție este în raport cu debitul dorit. Sistemul are dezavantajul de a genera o presiune în impulsuri și, prin urmare, necesită un amortizor de presiune. Pompele cu piston muta pereche de pistoane la o viteză constantă legată de debitul dorit și într-o direcție alternativă, în timp ce un piston se află în faza de aspirație, iar al doilea este în faza de distribuire și vice-versa. Pompele cu piston cu mișcare alternativă sunt capabile să susțină stabil presiuni de peste 600 atm, asigurând astfel rate de curgere bune și într-o gamă largă, ele sunt ușor adaptabile la țn gradientului.
Pompe seringă
Pompe Seringa, numita deplasare pompe, constau dintr-un cilindru care conține solventul și un piston intern. Pistonul este împins de un motor aplicat la un șurub, generând o presiune non-pulsate. Aceste pompe garanteaza un mediu stabil și flux suficient de puternic, cu toate acestea ele au de obicei o capacitate rezervor scăzută și au dezavantaje la schimbarea solventului.
pompe pneumatice
La pompele pneumatice, solventul este conținut într-un container flexibil, comprimat din exterior cu gaz sub presiune. Fluxul rezultat nu este în impulsuri, dar este, de obicei, nu foarte puternic, în comparație cu cea generată de alte tipuri de pompe. Alte dezavantaje sunt date de capacitatea redusă a rezervorului și prin faptul că entitatea a debitului depinde semnificativ de viscozitatea solventului, făcând astfel aceste pompe improprii pentru țn gradientului.
Sisteme de introducere a probelor
Reproductibilitatea cantitatea de probă introdusă în coloana reprezintă punctul critic pentru precizia unei analize cu HPLC. Sistemele folosite în prezent sunt în măsură să ajungă la precizii relative de 0,1% și pentru a varia cantitatea de probă introdusă într - un interval cuprins între 5 și 500 pl, există , de asemenea , supapa de injecție pentru micro probe cu volume între 0,5 și 5 pl. Acestea sunt valve capabile de locuințe și transferarea probei, fără a întrerupe fluxul de faza mobilă prin coloană. Acestea sunt construite din oțel.
Coloane
Este mediul în care se separă materialul, și în funcție de solvenții, analiții pot ajunge la diferite rate de eluare, de asemenea, pe baza compoziției lor. Cel mai material folosit pentru construcția de coloane HPLC este lustruit din oțel inoxidabil, dacă acționați la presiuni sub 10 atm utilizați și coloane de sticlă groase. Lungimea coloanelor este de obicei între 10 și 30 cm, dar este posibil să aibă coloane mai lungi pentru nevoi speciale. Diametrul interior este cuprins între 2 și 4,6 mm și diametrul particulelor de umplere între 3,5 și 10 pm. Există, de asemenea, modele de coloane recent concepute care sunt mai scurte și mai subțiri, care permit ori analiza mai scurte și diminuarea consumului de solvent.
coloanele comerciale sunt adesea echipate cu cuptoare cu termostat pentru a menține temperatura coloanei sub control până la o zecime de grad Celsius. Menținerea unei temperaturi constante de obicei, rezultate în cromatogramelor mai bune.
Deși solvenții utilizați în HPLC sunt purificate intenționat, este întotdeauna posibil ca acestea să conțină contaminanți care ar putea afecta funcționalitatea bună a coloanei. Pentru a depăși această problemă și, prin urmare, crește durata de viață medie a coloanelor analitice, se aplică coloane de protecție, care sunt mai scurte decât coloanele analitice, în care faza mobilă este trecut înainte de a accesa coloana analitică. Practic coloana protecție acționează ca un filtru. De asemenea, servește pentru a satura faza mobilă cu faza staționară, minimizând astfel pierderile faza staționară în coloana analitică.
umpleri Coloana
Umpluturile folosite în HPLC sunt , practic , de trei tipuri, cu particule de film, cu particule poroase și cu tehnologia fuzionate-core.
Particulele de film sunt folosite aproape exclusiv pentru coloanele de protecție. Ele sunt granule sferice și neporoase din sticlă sau din material polimeric, cu o dimensiune cuprinsă între 30 și 40 pm. Un strat poros de silice , alumină sau rășină schimbătoare de ioni este depus pe suprafața granulelor. Dacă este necesară o fază staționară lichidă, acesta poate fi aplicat prin adsorbție.
Particulele poroase au diametre cuprinse între 3 și 10 pm, materialul cel mai folosit este de silice microporoasă, dar ele pot fi de asemenea realizate din alumină sau rășină schimbătoare de ioni. De asemenea, în acest caz, se aplică acoperiri specifice, legate fie prin adsorbție sau prin legături chimice la suprafața particulelor.
Particulele fuzionată-core au o dimensiune mai mică de 2 um, în mod obișnuit, se obișnuiește să se atribuie numele de UHPLC (HPLC Ultra) pentru instrumentație care utilizează aceste coloane [1]
Detectoare
Pentru un detector pentru a fi adecvat pentru utilizare în HPLC trebuie să îndeplinească următoarele caracteristici:
- Sensibilitatea adecvată, care depinde în mod evident, atât pe nevoile specifice ale operatorului și tipul de probă de analizat
- bună stabilitate și reproductibilitate
- răspuns liniar pentru mai multe ordine de mărime
- Timpul de răspuns scurt
- de mare ușurință în utilizare și fiabilitate
- uniformitatea răspunsului față tuturor analiților sau, dimpotrivă, o specificitate înaltă pentru compuși particulari
- revelație non-distructive
- volum intern mic, pentru a evita lărgirea benzilor
Detectoarele Cele mai utilizate sunt de absorbție UV, atunci există metode de fluorescență (pentru proteine), pe indicele de refracție, constanta dielectrică, detectoarele electrochimice, spectrometru de masa si altele.
detectoare absorbanta
Celulele absorbanță pentru HPLC sunt , de obicei în formă de Z, au cale optică la 2 la 10 mm și volume între 1 și 10pl. Aceste celule mici rezista in mod normal presiunea câteva zeci de baruri. sunt folosite ambele detectoare de fascicul dual, în care un fascicul este trecut prin celulă și detectată cu compensarea celeilalte grinzii, atenuat printr-un filtru, iar detectoarele singur fascicul.
Regiunea de spectru cel mai adesea exploatate în detectori de absorbanță pentru HPLC este UV , în al doilea rând , există vizibil regiune și într - o mai mică măsură în infraroșu . Ambele detectoare de filtru ( fotometre ) și detectori monocromator ( spectrofotometre sunt utilizate).
Cele mai simple Fotometrele HPLC folosesc o lampă cu mercur , din care banda centrata la 254 nm este de obicei selectat, dar benzile la 250, 313, 334 și 365 nm sunt de asemenea utilizate. Diferite grupe funcționale absorb atât organice cât și anorganice, la aceste lungimi de undă. Deuteriu sau surse de wolfram sunt, de asemenea, folosite, echipate cu o serie întreagă de filtre. De obicei, gestionarea filtrelor este încredințată unui procesor electronic care optimizează alegerea.
Pentru detectoarele spectrofotometrului cu rețea de difracție , puteți alege diferite moduri de utilizare. Întreaga cromatograma poate fi scanat cu o singură lungime de undă; sau în cazul în care vârfurile eluatului sunt destul de separat, lungimi de undă specifice pot fi alese pentru fiecare vârf, în cazul în care a doua metodă este urmată, utilizarea unui procesor este esențială pentru a selecta lungimea de undă optimă pentru fiecare vârf. Puteți opri, de asemenea, fluxul fazei mobile, dacă doriți să obțineți un spectru într-o regiune de lungime de undă largă.
Domeniul de aplicabilitate al detectoarelor în infraroșu în HPLC este destul de slabă din cauza solvenților utilizați ca fază mobilă, de obicei apa sau alcooli, care au benzi de absorbție diferite în spectrul IR și risc care acoperă semnalele analiților.
detectoare fluorescenței
Fluorescenței detectoare au avantajul de o mai mare sensibilitate față de metodele de absorbție, de obicei , mai mult decât un ordin de mărime. Cu toate acestea, ei au dezavantajul unui domeniu inferior de aplicabilitate, deoarece numărul de specii absorbante este considerabil mai mare decât cele fluorescente. Cu toate acestea, detectoarele de fluorescență poate fi de asemenea utilizat pentru analiți non-fluorescente, dacă acestea pot fi tratate cu reactivi care dau produse fluorescente prin derivatizarea analit.
Fluorescenta se observă printr-un detector fotoelectric plasat la 90 ° în raport cu sursa de excitație, care este de obicei o lampă cu mercur. Radiația fluorescentă este izolat prin filtre. În cele mai multe instrumente sofisticate, sunt utilizate lămpi cu xenon și rețele de difracție.
Detectoare indicele de refractie
Detectoarele bazate pe variația indicelui de refracție datorită prezenței soluților în faza mobilă au marele avantaj de a avea un domeniu extrem de larg de aplicabilitate; ele sunt, de asemenea, foarte fiabile și nu sunt afectate de variațiile de flux. Cu toate acestea, ei au o sensibilitate slabă și selectivitate, acestea nu sunt aplicabile țn gradient de solvent (ar fi o deviere a liniei de bază) și au nevoie să fie termostatate la miime de grad Celsius, deoarece performanțele lor depind în mare măsură de temperatura și schimbarea vitezei fazei. mobil.
detectoare electrochimice
Există detectoare electrochimice pe bază de conductivitate , voltametrie , amperometry și coulometria . Ei au un domeniu larg de aplicabilitate.
Detectoarele de diode array
Acestea sunt detectoare de ultraviolete care, spre deosebire de detectoarele obișnuite, permit înregistrarea simultană a spectrului în funcție de lungime de undă , mai degrabă decât scanări performante, folosind o serie de diode . În acest fel, este posibil să se obțină grafice tridimensionale în funcție de absorbanță, lungime de undă și de timp, sau hărți de absorbție (timp față de lungime de undă), în plus față de spectrul UV clasic și Cromatogramele.
Detectoare Spectrometru de masa
Aplicabilitatea spectrometrului de masă ca un detector pentru HPLC este complicată de cantitatea mare de eluați provenind din coloana care nu reconciliază cu nevoia de vid înalt în analize spectrometru de masă. Prin urmare, o mulțime de muncă a trebuit să fie făcut pentru a dezvolta interfețe adecvate care elimină sau reduc solventul utilizat ca eluent.
In ionizare electrospray, faza mobilă din coloană se introduce într-un capilar de electropulverizare cu un debit de ordinul a 1 pl / min (este posibil să se mărească debitul de până la 1 ml / min, cu toate acestea înrăutățind semnal / zgomot raport). Capilarul este menținut la un potențial între 2,5 și 4kV în raport cu un electrod de contor. La capătul acului eluatului este nebulized, diferența de potențial forțează picăturile să-și asume o sarcină de suprafață aceeași polaritate ca sarcina acului. Picăturile sunt respinse de către ac și să facă drumul lor spre contra electrod. Ca picăturile traverseze spațiul dintre ac și contra electrod, există evaporarea solventului și o creștere în consecință a densității de încărcare de suprafață, ceea ce favorizează dezintegrarea picăturilor în picături mai mici și mai mici. Procesul are loc în cascadă , până când toate evaporarea solventului si reactia numai ionizate analit resturile care traversează contra electrod și trece la spectrometrul de masă. În procesul există puține fragmentare a analitului moleculelor, astfel încât spectrele sunt simplificate , dar sărac în informații.
În interfața termopulverizare, eluatul este introdus într - un capilar de oțel încălzit, în care analitul este vaporizat și ionizat. Ionizarea se produce datorită mecanismelor de transfer de sarcină induse de compuși, cum ar fi acetatul de amoniu sau trietilamina , a adăugat la eluent. O diferență de potențial este aplicat capilar care conduce ionizat analitului spre spectrometru de masă. Debitele adoptate sunt de ordinul a 2 ml / min. În ceea ce privește ionizare electrospray, există puțină fragmentare și, prin urmare, spectrele sărac în informații, în plus, acesta poate fi utilizat numai cu eluenți polare, singurele care pot solubiliza agenții tipice ionizata de transfer de sarcină.
Au fost dezvoltate numeroase alte interfețe, inclusiv ionizare chimică la presiune atmosferică (APCI) și fotoionizare la presiunea atmosferică.
Notă
- ^ UHPLC cromatografie în fază lichidă, într - adevăr „Ultra“? , Pe lab-italia.it. Accesat 02 iulie 2013 (arhivate din original pe 14 septembrie 2015).
Bibliografie
- DE Skoog, JJ Leary. Chimie analitică instrumentală . Edises, 1995
Elemente conexe
Alte proiecte
-
Wikimedia Commons conține imagini sau alte fișiere de pe cromatografie de lichide de înaltă performanță
linkuri externe
- (EN) cromatografie lichidă de înaltă Performanță , în Enciclopedia Britanică , Encyclopædia Britannica, Inc.
