Clonarea

Imaginea schematizează procedura de clonare așa cum este descris în stânga.

Clonarea , cu referire la fragmente de ADN , este un set de metode experimentale în biologia moleculară care descrie asamblarea moleculelor recombinate și, prin urmare, o serie de tehnici cu care este posibil să se obțină mai multe copii ale unei secvențe de nucleotide date, nu neapărat a o natură genetică .

Utilizarea termenului de clonare se referă la metoda care implică replicarea unei molecule pentru a produce o colonie de celule cu aceleași molecule de ADN.

În esență, există două tehnologii de clonare: prima, tot în ordine temporală (datează din anii șaptezeci), folosește enzime de restricție și vectori de clonare pentru clonarea ADN-ului. Fragmentul de interes trebuie izolat cu enzime de restricție și apoi introdus într-un vector (de obicei o plasmidă ) prin reacția ligazei. Vectorul astfel obținut este inserat în celula gazdă, care este cultivată în mediu selectiv.

Un al doilea tip de clonare, utilizat acum pe scară largă și care a revoluționat biologia moleculară, a devenit posibil în 1985 odată cu dezvoltarea reacției în lanț a polimerazei sau PCR . Pe scurt, această tehnică exploatează reacția catalizată in vivo de enzima ADN polimerază, în timpul duplicării semi-conservatoare a ADN-ului, pentru a face clonarea in vitro a oricărui fragment, de lungime adecvată, situat între două secvențe scurte de nucleotide numite primeri.

Istorie

Paul Berg

Înainte de 1970, înțelegerea noastră despre genetică și biologie moleculară a fost grav împiedicată de incapacitatea de a izola și studia gene individuale din organisme complexe. Situația s-a schimbat dramatic odată cu apariția metodelor de clonare moleculară. În 1971, Paul Berg , un biochimist american, după o perioadă petrecută la Universitatea Washington din St. Louis , s-a mutat la Universitatea Stanford unde a fost implicat în principal în ingineria genetică. El a reușit să îndepărteze și să transplanteze numeroase gene transferând ADN-ul de la un organism la altul. De fapt, el a integrat ADN-ul unor gene ale virusului maimuței SV 40 în cromozomul bacteriei Escherichia coli , care este capabilă să se înmulțească rapid. Cu această tehnică de inginerie genetică, a fost creată condiția prealabilă pentru cunoașterea structurii genelor și pentru intervenții directe asupra materialului genetic al organismelor. Berg a făcut prima clonare în 1972 și apoi în 1977 a clonat prima genă umană (somatostatina), care a permis bacteriilor să producă această proteină umană. Aceste studii i-au adus în 1980 Premiul Nobel împărțit cu Walter Gilbert și Frederick Sanger .

Elemente de clonare

Sunt necesare elemente pentru ca procesul de clonare să aibă loc; aceștia sunt vectorii, care trebuie să poată:

replică în cadrul unui organism gazdă (amplificare);
conțin regiuni neesențiale care pot fi înlocuite cu secvența de interes;
conțin regiuni care permit inserarea secvențelor (polilinker);
devin markeri genetici (utili pentru selecție);
să fie ușor extrase din celula gazdă.

Principalii transportatori sunt:

Enzime de restricție

Același subiect în detaliu: Enzime de restricție .

Enzimele de restricție sunt enzime produse de celulele bacteriene, care taie molecula de ADN. Fiecare enzimă se taie la locul său de restricție specific. De obicei tăieturile se fac oblic, adică lăsând baze nepereche. Aceste enzime din bacterii îndeplinesc o funcție de protecție împotriva infecției cu virus: atunci când materialul genetic viral este injectat în celulă, enzimele de restricție îl taie. Cu toate acestea, pentru a preveni enzimele să taie ADN-ul bacterian acolo unde nu ar trebui, are loc un proces numit metilare în metilază, care constă în adăugarea unei grupări metil la locurile de restricție ale ADN-ului bacterian. În acest fel, enzimele de restricție nu taie ADN-ul bacterian.

Prima enzimă de restricție descoperită a fost găsită într-o tulpină de Escherichia coli: EcoR1: E indică genul bacterian ( Escherichia ), co specia ( coli ), R tulpina de laborator (tulpina RY13 ^[1] ), 1 indică faptul că a fost primul identificat în acea tulpină bacteriană. Această enzimă de restricție se taie la secvența GAATTC în direcția 5 '→ 3'. Enzima EcoR1 asigură cele două fire ADN între guanină și adenină adiacente acesteia, obținând astfel două capete lipicioase.

 5 '... G AATTC ... 3'
     | |
3 '... CTTAA G ... 5'

Capetele nepereche vor fi complementare capetelor transgenului pe care doriți să îl introduceți în ADN-ul bacterian, astfel încât să se lege și ADN-ul bacterian să cuprindă transgenul. Problema care apare cu acest tip de tăiere este că cele două capete de coeziune sunt identice, astfel încât transgenul poate fi încorporat în ambele direcții. Dacă îl introduceți în direcția corectă, acesta codifică corect, în timp ce, dacă îl introduceți înapoi, nu codifică corect. Din acest motiv, trebuie utilizate două enzime de restricție diferite care taie ADN-ul bacterian lăsând capete diferite, astfel încât transgenul să poată fi introdus corect. De exemplu segmentul ADN

 5 '... GAATTC ... GGATCC ... 3'
3 '... CTTAAG ... CCTAGG ... 5'

atunci când este tăiat de enzimele de restricție EcoRI și BamHI devine

 5 '... GAATT C ... G GATCC ... 3'
3 '... C TTAAG ... CCTAG G ... 5'

și pierde partea centrală care este înlocuită de transgenul care va avea ca extremitate:

 5 '... 3'
3 'TTAA ... CTAG 5'

care se leagă în mod unic de ADN-ul bacterian:

 5 '... GAATT ... GATCC ... 3'
3 '... C TTAA ... CTAG G ... 5'

Problema cu această tehnică este că fiecare enzimă de restricție are nevoie de propriul tampon. Cu toate acestea, este posibil să se utilizeze enzime de restricție care nu lasă capete de coeziune identice, cum ar fi Bsu36I care identifică segmentul:

 5 '... CCTNAGG ... 3'
3 '... GGANTCC ... 5'

(unde perechea de nucleotide N poate fi oricare) și o taie după cum urmează:

 5 '... CC TNAGG ... 3'
     || ||
3 '... GGANT CC ... 5'

Prin urmare, se remarcă faptul că capetele coezive nu sunt identice, deoarece N în filamentul 3 '→ 5' este complementar cu N în filamentul 5 '→ 3', de exemplu:

 5 '... CC TTAGG ... 3'
     || ||
3 '... GGAAT CC ... 5'

Deci, o transgenă la capetele căreia prezintă:

 5 'TTA ... 3'
3 '... AAT 5'

se poate lega într-un mod unic și direcțional în ADN:

 5 '... CC TTA ... TTAGG ... 3'
3 '... GGAAT ... AAT CC ... 5'

Acest lucru permite inserarea unei transgene în direcția corectă folosind o singură enzimă de restricție.

Plasmide

Același subiect în detaliu: Plasmide .

Două tipuri de inserție a unei plasmide într-o bacterie gazdă; mai sus, plasmida nu se integrează cu ADN-ul bacteriei, în timp ce mai jos

Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomiale care se replică autonom în celulele bacteriene . În mod normal, plasmidele au ADN circular dublu catenar, deși există dintre plasmidele cu ADN liniar. În interiorul celulelor E. coli , ADN-ul plasmidic este situat într-o formă caracteristică, în care condensul ADN circular dublu catenar în spațiul din jurul axei helixului dublu. Această structură se numește „structură supraînfășurată” și este cea prezentă în natură.

Plasmidele utilizate ca vectori de clonare sunt derivați ai plasmidelor naturale, specializate pentru a îndeplini cerințe foarte specifice:

conțin o secvență, numită secvența ori (de la origine), care funcționează ca origine a replicării ADN-ului plasmidic în celulele gazdă bacteriene și care, prin urmare, permite plasmidelor să se replice ca elemente extracromozomiale. Prin urmare, replicarea ADN-ului plasmidic are loc independent de replicarea ADN a cromozomului ;
conțin cel puțin un marker selectiv care permite să se distingă celulele gazdă care conțin plasmida de cele care nu o conțin; de exemplu markeri selectivi , genele care conferă rezistență la antibiotice sunt utilizate în mod normal ca markeri selectivi.
un vector de clonare bun trebuie să conțină o zonă în care este posibilă „inserarea” ADN-ului exogen de clonat. Această zonă, care se numește polilinker , sau zonă de clonare multiplă, este alcătuită dintr-o întindere de ADN care conține secvențe, numite site-uri de restricție , care sunt recunoscute ca site-uri de scindare de către enzimele de restricție .

Cosmide

Un cosmid este un vector care folosește gene specifice λ („lambda”). Cosmidele sunt vectori plasmidici în care au fost inserate situri cos (capete de coeziune) ale genomului λ. Aceste site-uri sunt necesare pentru ambalarea ADN-ului în virionul λ. Plasmidele modificate pot fi ambalate în virion in vitro, iar particulele de fag utilizate pentru infectarea Escherichia coli. Prin urmare, folosind cosmide, nu este necesară transformarea E. coli, care este un proces ineficient.

Bacteriofagii

Fagii (sau bacteriofagii ) sunt virusuri formate dintr-o coadă și un cap care conține genomul pe care îl eliberează odată ce celula este infectată. Fagii adecvați pentru clonare sunt fagul λ și fagul M13. Fagul λ permite clonarea mică, cel mult până la 20 kB, acest lucru se datorează ADN-ului său ambalat în capul în formă de icosaedru. Coada, pe de altă parte, este formată din constituenți codificați de genomul fagului. Fagul M13, pe de altă parte, este mai eficient și este capabil să cloneze ADN mare deoarece firul său genetic unic nu are constrângeri. Fagul M13 este denumit și masculin, deoarece intră în celula gazdă prin pilus, un apendice bacterian care promovează interacțiunea cu alte organisme.

BAC

Un cromozom artificial bacterian (BAC) este un vector ADN creat artificial pe baza plasmidei F izolată din E. coli. BAC se distinge prin capacitatea sa de a transporta o cantitate mai mare de ADN decât vectorii naturali. De fapt, acesta oscilează între 100 kB și 300 kB, de 10-30 de ori mai mare decât plasmidele . Pentru a introduce BAC-urile în interiorul unei celule, se exploatează electroporarea, prin care crește permeabilitatea membranei.

YAC

Cromozomii artificiali de drojdie (YAC) sunt vectori de cromozomi artificiali eucarioti ai drojdiei care posedă telomeri , centromeri de duplicare în mai multe puncte. De asemenea, dețin mai multe situri de restricție care le permit să aibă o capacitate de transport până la 1400 kB, până astăzi sunt printre toți vectorii care transportă mai multe regiuni ale ADN-ului.

Etapele clonării

Procesul de clonare necesită 4 etape: izolarea unei secvențe ADN , inserarea secvenței într-o celulă gazdă, multiplicarea celulelor receptor și selecția celulelor .

Izolare

Proces de izolare

Clonarea se poate face pe o secvență ADN a genomului sau pe o copie ADN a unui ARN mesager (ARNm). În primul caz, pot fi luate și secvențe necodificate, în timp ce în al doilea poate fi izolată doar secvența exprimată a unei gene , o metodă preferată în biotehnologie . Dacă alegeți o moleculă de ARNm , o enzimă, numită transcriptază inversă , este utilizată pentru a o insera în genom, ceea ce îi permite să fie reconvertită în ADN. Copia unei secvențe de ARNm se numește ADN complementar (ADNc), setul acestora se numește bibliotecă de ADNc . Izolarea secvenței de ARNm afectate are loc datorită caracteristicii sale de a avea o coadă poli-A la capătul 3 ', formată din adenozină , ARN - ul este scufundat într-o rășină care conține lanțuri poli-T care se leagă de cozile poli-A, ARNm rămas este apoi colectat în forma sa pură.

Inserare

Vectorii plasmidici sunt utilizați pentru a insera moleculele de ADNc selectate. Pentru a insera secvența aleasă în vector este necesar să tăiați o secvență ADN plasmidică și să o înlocuiți cu cea selectată. În acest moment este necesar să se utilizeze anumite enzime bacteriene, endonucleaze de restricție, capabile să se lege de anumite secvențe de ADN și să taie dubla helică în locurile de tăiere corespunzătoare, pentru a pregăti ADNc și vectorul pentru inserție. Inserția propriu-zisă are loc prin ligazele ADN , enzime care restabilesc legătura fosfodiesterică între nucleotide, prin unirea a două fragmente de ADN distincte.

Multiplicare

Înmulțirea și selecția

ADN-urile recombinate care conțin ADNc sunt inserate în celulele gazdă bacteriene. Vectorii conțin, de asemenea, o plasmidă de rezistență la o anumită substanță; doar unele bacterii , cele care conțin factorul de rezistență la antibioticul în care sunt făcute să se reproducă, supraviețuiesc. Acestea posedă toate secvențele ADNc. Fiecare celulă va genera o clonă a unui ADNc unic. Setul de clone este biblioteca ADN.

Selecţie

Electroforeza pe gel de agaroză

Pentru a înțelege în ce bacterii este prezentă secvența ADNc, se folosește metoda Southern Blotting. Acest proces constă din trei faze:

Electroforeză pe gel de agaroză : cADN-urile digerate sunt plasate în godeuri formate prin solidificarea unui amestec care conține agaroză. Prin aplicarea unui câmp electric, ADN-ul (încărcat negativ) se deplasează spre polul pozitiv și moleculele se separă în funcție de greutatea moleculară. Vectorul mai greu va merge mai lent decât ADNc (mai ușor).
Transfer : dubla helix ADN este deschisă și plasată pe o membrană de nitroceluloză .
Hibridizare : se prepară în laborator o moleculă de ADN complementară secvenței care conține o moleculă de fosfor radioactiv (32P), ușor de recunoscut prin fosforescență. ADNc de interes se leagă spontan de molecula complementară, astfel încât să fie recunoscut.

Aplicații ale clonării

Utilizări de proteine recombinante

Proteinele recombinante sunt obținute în urma transcrierii și traducerii unui fragment de ADN recombinant. Pentru a le obține, gena care codifică proteina trebuie clonată în „vectori de expresie” care conțin semnalele de inițiere a fazelor de transcriere și traducere.

Ele sunt, de asemenea, utilizate în domeniul medical pentru:

VACCINE RECOMBINANTE precum difterie , hepatită B , gripă , malarie , rujeolă , pertussis , poliomielită , tetanos și, deși încă în faza experimentală, hepatita C și HIV ;
HORMONI, cum ar fi ACTH, hormon foliculostimulant , tiretropină , HGH (hormon de creștere), EPO , somatrotopină , calcitonină , glucagon , insulină
BIO PEPTIDE ACTIVE cum ar fi interferoni , interleukine ;
HEMOGLOBINE;
LEPTINA UMANĂ (proteină secretată de celulele adipoase capabile să controleze greutatea corporală);
FACTORI NEUTROFI precum HNG (factor de creștere a nervului uman), BGNF (factor neutrofic derivat din creier), NT-3 (neutrofină-3), NT-4 (neutrofină-4), GDNF (netrofină derivată din celule gliale), CNTF;
INHIBITORI DE PROTEAZĂ.

Organizarea genomului și expresia genei

Clonarea a avut un rol esențial în secvențierea ADN-ului unei game largi de specii și explorarea diversității lor genetice. Această lucrare a fost realizată prin determinarea secvenței ADN a unui număr mare de fragmente clonate aleatoriu ale genomului și asamblarea secvențelor suprapuse.

La nivelul genelor individuale, celulele clonate sunt utilizate ca sonde moleculare utile pentru examinarea modului în care genele sunt exprimate și modul în care expresia este legată de alte procese biologice, cum ar fi metabolismul, semnalele extracelulare, dezvoltarea, învățarea, îmbătrânirea și moartea celulară. Genele clonate pot oferi, de asemenea, instrumente pentru analiza funcției biologice și a importanței genelor individuale.

Organisme transgenice

Odată caracterizate și manipulate pentru a oferi semnale pentru o expresie adecvată, genele clonate pot fi inserate în organism, generând organisme transgenice, numite și organisme modificate genetic (OMG-uri). În timp ce multe OMG-uri sunt generate pentru cercetarea biologică, o serie de OMG-uri au fost dezvoltate pentru uz comercial, variind de la animale și plante producătoare de droguri sau alți compuși, plante de grâu rezistente la erbicide și pești tropicali fluorescenți pentru acvarii (GloFish).

Terapia genică

O aplicare a clonării are loc în terapia genică , adică inserarea materialului genetic (ADN) în celule pentru a trata patologiile legate de defect sau absența uneia sau mai multor gene. Terapia se poate referi atât la celulele germinale , care aduc modificări întregului organism și la generația filială, cât și la celulele somatice . Prima aplicare a avut loc în anii șaptezeci, în timp ce în 1990 William French Anderson a creat prima terapie genică aplicată unei ființe umane, o fată cu SCID . Practica a ridicat multe critici și nu a avut întotdeauna succes, deoarece unii pacienți au murit sau, în unele cazuri, genele au fost infectate cu viruși în timpul terapiei.

Sitografie

Notă

^ D. Sadava G. Heller G. Orians W. Purves D. Hillis M. Pignocchino, Restriction enzymes cut DNA at certain sequences , on ebook.scuola.zanichelli.it . Adus la 26 mai 2016 .

Elemente conexe

Alte proiecte

Wikționarul conține dicționarul lema « clonare »
Wikimedia Commons conține imagini sau alte fișiere despre clonare

Controlul autorității	Tesauro BNCF 39614 · LCCN (EN) sh85086580 · GND (DE) 4123275-6 · BNF (FR) cb121941043 (dată) · BNE (ES) XX549823 (dată)

Portalul de biologie : Accesați intrările Wikipedia care se ocupă de biologie

[1] D. Sadava G. Heller G. Orians W. Purves D. Hillis M. Pignocchino, Restriction enzymes cut DNA at certain sequences , on ebook.scuola.zanichelli.it . Adus la 26 mai 2016 .

[1]