ADN recombinant în botanică
Această intrare sau secțiune despre subiectele acizilor nucleici și botanică nu citează sursele necesare sau cei prezenți sunt insuficienți . |
Această intrare tratează ADN-ul recombinant în botanică și referințe specifice la plantele transgenice .
Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens
ACOLO. tumefaciens este un gram negativ aerobic bacterie care induce tumori in zona de infectie , cunoscut sub numele de Galla del coletto , adică, partea a frontierei dintre tulpina și rădăcini . Celulele infectate dobândesc proprietatea de a crește într-un mod nereglementat și o mențin chiar dacă bacteria nu mai este prezentă; sunt, prin urmare, adevărate celule tumorale al căror genom a fost totuși integrat cu porțiuni străine.
Celulele deteriorate ale unei plante (de exemplu, dintr-o leziune) eliberează factori (cum ar fi acetoziringona) care activează genele vir din bacterie, responsabile de virulență , localizate în plasmida Ti care induce tumora. Proteinele cu funcție de factor de transcripție vor fi sintetizate.
Plasmidele sunt molecule ADN circulare extracromozomiale care nu sunt strict necesare bacteriilor, dar care aduc beneficii. Acestea conferă rezistență la antibiotice , patogenitate, capacitatea de a metaboliza substanțe neobișnuite în nutrienți etc. Sunt transmisibile atât pe verticală de la bacterie la descendenți, cât și orizontal de la bacterie la bacterie. În ingineria genetică sunt folosiți ca vectori pentru transportul ADN-ului.
Această plasmidă conține, de asemenea, un segment numit ADN-T , care transportă gene pentru sinteza opinelor , enzimelor care degradează opinele și fitohormonii ( auxine și citokinine ) responsabili de simptomele bolii.
Segmentul plasmidei Ti sălbatic:
| Gene vir | Bordura stângă | ADN-T | Limita dreaptă | ||
| Opini | Enzime | Hormoni | |||
Sinteza opinelor (derivați de aminoacizi ) are loc datorită unor enzime codificate de ADN-T care duc la modificarea anumitor aminoacizi pe care numai bacteria infectantă le poate metaboliza ca sursă de carbon și azot .
ADN-ul T în urma producerii TF (factorii de transcripție) de virulență, este excizat la înălțimea celor două secvențe de frontieră în amonte și în aval de ADN-ul T în sine, care trece ca o singură catenă în celula plantei într-un proces asemănător conjugării bacteriene. Plasmida este reparată prin replicarea ADN-ului. Odată ajuns în celulă, tot ce rămâne pentru ADN-T este să intre în nucleu și să se integreze cu ADN celular la un loc aleatoriu în cadrul unui promotor de gene și în afara unei secvențe de codificare, de obicei în mai multe copii. Aceasta înseamnă că fitohormonii (auxine și citokinine) sunt produse cu căi metabolice diferite de cele utilizate în mod normal de plantă și pe care nu le poate controla; aceasta subminează metabolismul celulei punându-l în serviciul parazitului său genetic sofisticat. Mai mult, producția excesivă de fitohormoni în celulele vegetale infectate determină creșterea anormală a țesuturilor infectate. În scopul infecției, ADN-ul T original nu este important, de fapt vectorii de transformare agrobacteriană utilizați în ingineria genetică sunt numiți „dezarmați”, deoarece ADN-ul T original este înlocuit cu genele care urmează să fie exprimate în plantă .
Pe scurt, procesul de infecție constă din:
- Chimiotaxie și legarea inițială a bacteriei la locul leziunii;
- Dezvoltarea unei ancore solide;
- Începutul exciziei ADN-T și ambalarea proteinelor ;
- Construirea canalului transmembranar;
- Migrarea ADN-ului T în celula vegetală;
- Migrarea ADN-ului T în nucleu, integrare și transcriere.
Agrobacterium rhizogenes
Există, de asemenea, A. rhizogenes , un alt gram negativ care conține plasmida Ri care induce rădăcina în locul plasmidei Ti. Cu aceeași procedură, ghidează celulele în care este integrat pentru a se diferenția în rădăcini, numite rădăcini păroase , de asemenea în care sunt produse opiniile . Plantele transgenice întregi care conțin ADN-T transformant ar putea fi obținute din rădăcini păroase induse de bacterie, direct sau mai des prin cultură tisulară. Analiza fenotipică a acestor indivizi a evidențiat o serie de modificări caracteristice numite fenotip rădăcini păroase. Deși cu unele diferențe între speciile studiate, plantele transgenice au o culoare verde mai intensă în frunze , o înălțime mai mică datorită scurtării internodurilor, pierderea dominanței apicale cu o dezvoltare mai mare a mugurilor axilari, ondularea frunzelor, o rizogeneză accentuată cu pierderea parțială a geotropismului radical 2.1, o reducere a fertilității și a producției de semințe, iar la speciile bi- și multi-ani o reducere a duratei de viață. Toate acestea nu ar sugera cu siguranță o posibilă utilizare a unui grup de gene capabile să declanșeze astfel de modificări negative ale plantei.
ADN-ul T al lui A. rhizogenes, din care este cunoscută secvența nucleotidică, este compus din 18 cadre de citire deschise (ORF), adică probabil din 18 funcții genetice diferite, a căror disecție și transferul lor către plantă au permis să se constate că fenotipul rădăcinii păroase poate fi indus prin transferarea în plantă a doar trei dintre cele 18 gene prezente în ADN- T, în special ORF 10, 11, 12 (conform unei definiții genetice rol A, B, C, unde rol înseamnă locusul rădăcinii ) și că intensitatea modificărilor este o funcție atât a numărului de copii ale fragmentului T-ADN prezent, cât și a nivelului de exprimare a genelor în sine.
Metoda de integrare
Având în vedere premisele, a fost, prin urmare, bine gândit să exploateze aceste cunoștințe pentru a introduce un caracter util într-o plantă . Această metodă a fost dezvoltată pentru a evita problemele asociate cu manipularea fragmentelor de ADN la fel de mari ca plasmida Ti. ADN-ul T a fost donat în vectorul standard E. coli pBR322 împreună cu gena NPT2 (pentru rezistența la kanamicină ), gena AMP r (pentru rezistența la ampicilină ) și gena de interes. Rezultatul este așa-numita plasmidă integrativă .
Sunt operații simple de overlock efectuate cu enzime de restricție adecvate, adică separând cel mai mic fragment posibil fără a atinge gena utilă.
Plasmidă integrativă:
-------------------------------------
| | | | |
-------------- | ADN-T | genă | NPT2 | AMPr | --------------
| | | | | | |
| ------------------------------------- |
| |
-------------------------------------------------- ---------------
Plasmida (care se află în eprubetă ) este transformată în E.Coli și sunt selectate bacteriile transformate cu ampicilină (și aici este util markerul care dă rezistență la ampicilină, pBR322). Acestea sunt aduse în contact cu Agrobacteria intactă și, în condiții adecvate pentru conjugare , plasmida recombinantă este transferată la Agrobacterium, care va avea acum Ti normal și plasmida integrativă. Ambele au fragmentul ADN-T, ale cărui secvențe pot interacționa pentru a da recombinare omologă, adică fuziunea plasmidei integrative, de aproximativ 5 kilobaze (kb) mare, cu plasmida Ti mai mare (200 kb). Plasmidele care nu se integrează nu se acumulează deoarece le lipsește o origine de replicare pentru Agrobacterium (așa-numitul oriC din E.Coli). Agrobacteriile care conțin plasmida Ti recombinată sunt selectate cu kanamicină (și aici este util celălalt marker utilizat, NPT2). Sistemul este extraordinar de eficient, până la 50% din protoplastele tratați conțin și exprimă ADN-ul transferat de la Agrobacterium. Această eficiență ridicată a transformării ne permite să selectăm și să clonăm cu ușurință protoplastele modificate.
Sistem binar
Acum este metoda standard pentru transferul ADN-ului T. Se folosește de două plasmide, vectorul binar și plasmida de ajutor . Vectorul binar este pur și simplu o plasmidă Ti fără ADN-T, în locul căreia gena care urmează să fie transferată către plantă și un marker de selecție sunt inserate între marginile din dreapta și din stânga. Un alt marker este plasat în afara granițelor pentru selecția viitoare în E. coli . Rețineți că acest vector menține originea replicării pentru Agrobacterium.
Vector binar
-------------------------------------------------- --------------- | Marker | stânga | genă | Marker | dreapta | | Originea | --- | bacterian | frontieră | | pentru bataturi | frontieră | --- | replicare | --- | | | | | | | | | | | -------------------------------------------------- --------------- | | | -------------------------------------------------- ------------------------
Plasmida helper este o plasmidă Ti fără ADN-T, dar totuși cu genele vir. Vectorul binar este transformat în E. coli, după selecție transformanții sunt conjugați cu o tulpină de Agrobacterium care conține plasmida de ajutor, dar nu Ti. În acest fel, după activarea de către o plantă rănită, proteinele genelor vir (ale plasmidei ajutătoare) translocează fragmentul ADN între cele două margini (ale vectorului binar) în celula plantei. Vectorul binar, adică plasmida care conține ADN-ul de transferat, este menținut ca un vector care se reproduce separat în Agrobacterium; aici se află diferența cu metoda cointegrării.
Tehnica discului de frunze
Nu este ușor să crești plante întregi din protoplaste, chiar și pentru cele mai potrivite specii. O îmbunătățire a venit cu această tehnică, deoarece frunzele sunt o sursă bună de celule regenerante. Formele mici de disc sunt decupate din frunze, ale căror margini sunt ușor infectate dacă sunt inoculate cu Agrobacteria. Discurile sunt apoi transferate pe hârtie de filtru plasată peste celulele nutritive care produc factori de creștere . După 2-3 zile de cultură, este transferat în mediul stimulator al germinării ( citokinine ) unde celulele care transportă plasmida sunt selectate datorită unui marker ( antibiotic ). Pentru a nu risca răspândirea Agrobacteriei recombinate în mediul înconjurător, se adaugă un antibiotic precum cefotaxima , care ucide bacteria.
Lăstarii se dezvoltă în câteva săptămâni, apoi se mută în sol care induce formarea rădăcinilor (auxine). Întregul proces durează 4 până la 7 săptămâni și se aplică unei varietăți largi de dicotioane .
Marcatori de selecție
Genele reporter ne oferă sprijin în vizualizarea celulelor transformate. Gena E. coli pentru enzima β-glucuronidază (GUS) este adesea asociată cu ADN - ul care urmează să fie transfectat către plante, deoarece acestea au niveluri neprețuite ale acestei enzime. Când celulele care exprimă GUS sunt incubate cu X-glucuronidă, se produce o pată albastră care este detectabilă prin metode histochimice . Sau dacă se folosește un substrat diferit, GUS poate fi măsurat cantitativ cu un fluorometru . Singurul dezavantaj este că celulele trebuie ucise pentru analize histochimice. În caz contrar, folosind gena luciferazei ca genă raportoare, lumina este produsă când se adaugă adenozin trifosfat (ATP) și luciferină la mediul de cultură, care poate fi detectat și prin intermediul unui film fotografic. Adesea, când sunteți deja sigur de o metodă și nu este nevoie să confirmați transformarea, antibioticele sunt utilizate pentru a elimina direct celulele netransformate.
Utilizarea virușilor
Virușii ar fi soluția ideală pentru a transfera ADN-ul către toate celulele unei plante adulte, deoarece s-au adaptat în evoluție pentru a face exact acest lucru, dar aproape toți virusurile plantelor sunt ARN . Doar două clase de ADN care conțin virusuri sunt cunoscută, conopidei virusul mozaicului ( caulimovirus ) și Geminviruses . Caulimovirusul are o mică moleculă circulară de ADN, se răspândește în plantă prin sistemul vascular și nu poate fi transmis prin semințe. Ultima caracteristică este foarte interesantă, deoarece vă permite să controlați răspândirea noilor gene, dar virusul mozaicului conopidei are două dezavantaje majore, infectează doar câteva plante din familia conopidelor și este capabil să transporte în capsidă doar secvențe scurte ADN (300 -400 baze ). Geminivirusurile au genomuri formate din două molecule monocatenare de ADN, fiecare trecând printr-o formă replicativă cu catenă dublă. Numai molecula A este capabilă să se replice în celulele plantei, dar molecula B este necesară pentru infectivitate. Proteinele de acoperire pot fi eliminate pentru a face loc unei transgene . ADN-ul A poate fi apoi inserat între secvențele de margine ale ADN-ului T, și astfel ADN-ul B între alte margini, pentru a constitui vectorul binar, care va fi utilizat în sistemul binar.
Alte
Transformarea directă
Soarta unui acid nucleic introdus ca atare într-o celulă este să fie degradată enzimatic rapid. Unele celule, numite celule competente , sunt în anumite condiții și acceptă integrarea ADN-ului străin în genom . Principalul avantaj este că necesită o manipulare redusă a ADN-ului, dar are încă o rată de transformare destul de scăzută, în jur de 1%.
Microinjecție
Prin manipularea unui ac de sticlă foarte subțire cu mecanisme care permit mișcări minime și lucrul constant la microscop, este posibil să străpungă membrana unei celule fără a o ucide și a injecta cantități mici de ADN. Micro injecție poate depăși problemele asociate cu utilizarea de protoplaști și in vitro culturi cu monocotiledonate care sunt importante pentru agricultură. În teorie ar fi suficient să se injecteze gena în polen și să o implanteze în ovarul speciei pentru a obține sămânța transgenică și, prin urmare, planta.
Bombardarea
ADN - ul poate fi precipitat cu CaCl2 la tungsten (sau aur ) sfere de 1 pm în diametru și a tras cu un pistol special pe obiective diferite , la o viteză de aproximativ 430 m / s. Pistolul și camera de eșantionare trebuie să fie vidate 2.2, în caz contrar, rezistența la aer încetinește micro-proiectilele. Țintele utilizate până acum sunt culturi suspendate de celule embrionare placate pe filtre, frunze intacte și miez de porumb . Celulele situate în traiectoria de tragere directă sunt ucise, dar există o zonă concentrică în care gloanțele pătrund fără a ucide celula . Analiza cu vectorul GUS a arătat că particulele pătrund în mezofila frunzelor prin epidermă . Un rezultat important a fost obținut cu această tehnică în fabricarea celulelor embriogene de porumb rezistente la un erbicid (PPT, fosfinotricină).
Testele finale
Ajuns la punctul în care a fost posibilă creșterea unei plante transgenice, este necesar să se efectueze teste pentru a evalua:
- Activitatea genei introduse;
- Heritabilitatea genei;
- Efecte neașteptate asupra creșterii, calității plantelor etc.
Dacă o tulpină transgenică trece aceste teste, cel mai probabil nu va fi cultivată oricum, dar va fi supusă unei serii de încrucișări pentru a face tulpini și mai bune. Acest lucru se datorează faptului că puținele soiuri ale unei specii care pot fi transformate eficient nu posedă, în general, toate calitățile cerute de producător și consumator. Prin urmare, planta transgenică este supusă unor încrucișări repetate cu o plantă de o varietate mai bună pentru a recupera cât mai mult posibil din genomul acesteia din urmă cu adăugarea transgenului . Următorul pas este reprezentat de teste pentru a evalua performanța plantei transgenice de-a lungul anilor și în diferitele medii în care va fi cultivată, cum ar fi câmpul sau sera . Această fază include, de asemenea, evaluarea efectelor asupra mediului și siguranței alimentelor .
Lista este în mare parte incompletă, de asemenea, deoarece nu este încă pe deplin cunoscută; Pentru a încadra mai bine argumentul, putem spune că încrucișările convenționale implică întregul organism , tehnicile de propagare clonală vizează celulele, ingineria genetică manipulează molecula ADN.
